マウス脳組織の機械的特性を評価するためのインパクトインデンテーション

要約

出典:Canovic, E. P., et al., Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry.J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、インパクトインデンテーションを使用して、プローブの変位と速度解析を通じて、剛性、エネルギー散逸、減衰など、水和したマウス脳組織の機械的特性を測定する方法を示します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. インパクトインデンテーション
   1. メーカーの指示に従って、インスツルメンテーションされたナノインデンターを調整し、デフォルト設定を調整して、水和した脳組織に対する動的インパクト実験を可能にします。
      1. 球形プローブをピンセットを使用して振り子にスライドさせて取り付けます。
      2. 融合した石英サンプルをサンプルポストに接着し、並進ステージにねじ込みます。
      3. キャリブレーションメニューに移動し、「リキッドセル」を選択します。ソフトウェアの指示に従って、溶融石英サンプルに接触させます。
      4. [圧子タイプ]で[Normal]を選択し、[Indenter Load]でデフォルト値の0.05 mNを使用します。「続行」をクリックして、通常の圧子構成のキャリブレーションを実行します。
      5. サンプルステージを少なくとも5 mm後退させ、プローブを液体セルに下げることができるレバーアームを取り付け、インデンタータイプに「液体セル」を選択して、新しい構成で液体セルのキャリブレーションを繰り返します。「Continue」をクリックして、Liquid Cell Calibration Factorを取得します。
      6. Experiment メニューに進み、「Special Options」を選択して、Liquid Cell ソフトウェアオプションをアクティブにします。最新のキャリブレーション値を使用してください。
      7. コンデンサプレートの間隔を広げると、コンプライアンスの高い材料を試験する際に必要な最大測定可能深度が大きくなります。
         1. システムメニューで「Non Protected Settings」と「Machine Parameters」を選択し、振り子試験負荷率、ゼロ負荷率、スタンバイランプオフセットをそれぞれ0.5 mN/秒、0.1 mN/秒、3 Vに変更してください。
         2. レンチで、コンデンサプレートの間隔を制御する3つのナットを時計回りに少しずつ回します。
         3. 時計回りに完全に回転するたびに、メンテナンスメニューの「ブリッジボックス調整」を選択し、カウンターバランスウェイトを振り子から離す必要がある適切な振り子テストを取得します。
         4. おおよその深度キャリブレーションが70,000 nm / V以上の値を読み取るまで、手順1.1.7.2〜1.1.7.3を繰り返します。
      8. 振り子の下部に新しいリミットストップを配置し、電源を介してオンとオフを切り替えることができます。振り子の後ろにある元のリミットストップを引っ込めて、振り子の動きの潜在的な障害物を取り除き、より速い衝撃速度と準拠したサンプルへのより高い浸透深さを可能にします。
      9. キャビネットが熱平衡に達するまで待ちます(約1時間かかります)。
      10. キャビネットが平衡化している間に、システムメニューに戻り、「保護されていない設定」と「マシンパラメータ」を選択します。深度キャリブレーション(dcal)の接触速度を1μm/secに、一次圧痕の接触速度を3μm/secに、超低負荷の接触速度を1μm/secに設定します。
      11. [キャリブレーション] メニューで、この新しい構成で標準の深度キャリブレーションを実行します。
      12. ソレノイドの電源をオンにし、10Vに設定します。Experimentメニューに移動し、「Impact」と「Adjust Impulse Displacement」を選択します。ソフトウェアの指示に従って(自動プロンプト)、振り子のスイング距離を調整します。
2. マウスの脳組織を液体セルにマウントします。
   脳
   1. 全体を採取した後、すぐにCO₂に依存しない栄養培地に氷上の成体神経組織培地として保存してください。
   2. インパクトインデントのセットアップが完全に完了したら、脳をCO₂に依存しない培地とともにペトリ皿に慎重に移します。脳を厚さ6mmのセクションにスライスし、両側に平らな面があります。
   3. スライスした組織をシアノアクリレート接着剤の薄層でアルミニウムサンプルポストに接着します。
   4. 液体セルをサンプルポストの2番目のOリングの上にスライドさせ、液体セルに5 mlのCO₂非依存培地を充填して、組織を完全に浸します。次に、このサンプルポストを、計装されたナノインデンター内の並進ステージに慎重に取り付けます。
3. 脳組織の衝撃応答を測定します。
   1. 必要であれば、球形プローブを取り外し、レバーアームを取り外すことなく目的のプローブと交換してください。
   2. [システム]メニューで、[保護されていない設定]と[マシンパラメータ]を選択します。一次衝撃接触速度を5μm/secに変更します。
   3. サンプルバスを低く(-z方向)、振り子(+x方向)から遠ざけた状態で、レバーアームの先端がバスの上に適切に配置されるまで-x方向に移動します。先端が浴槽に完全に沈み、サンプルの前に来るまで、+z方向に移動します。
   4. サンプルステージコントロールウィンドウを使用して、慎重に接触させてから、ステージをサンプル表面から約30μm離します。
   5. [実験] メニューで [影響] をクリックして、影響実験を設定します。スイング距離のキャリブレーションに基づいて、結果として得られる衝撃速度に直接関連する特定のインパルス荷重を選択します。スケジュールされたテストを実行します。
   6. 振り子が後ろに振れ、サンプル表面が測定面に移動し続ける場合は、下限停止スイッチをオフにします。
   7. 振り子が前方に振れてサンプルに衝撃を与えるのを観察します。時間の関数としてのプローブの変位は、ソフトウェアによって記録されます。
   8. xyzステージウィンドウが表示されたら、リミットストップスイッチをオンに戻します。
   9. 手順3.4〜3.8を繰り返して、必要な数の異なる負荷と場所をテストします。
4. カスタマイズされた MATLAB スクリプトを使用して、振り子の取得変位と時間応答を解析し、最大貫通深さ x最大、エネルギー散逸容量 K、散逸品質係数 Q を決定します。
   1. 分析メニューに移動し、データをテキストファイルにエクスポートしてください。
   2. 変位プロファイルの時間微分を使用して、速度を時間の関数として求めます。接触点として変位をゼロに設定しますxo1.
      注:衝撃速度vは、接触直前の最大速度です。xmaxは、プローブ速度が最初にゼロに減少する変形に対応します。XO2はXRに相当し、次のサイクルで変形したサンプルとの接触を再開するために必要な位置です。反発速度 vout は、変位 xr での速度です。
   3. K(単位なし)を、サンプルによって散逸されたエネルギーを、最初の衝撃サイクル中に回収されたサンプルエネルギーと散逸されたサンプルエネルギーの合計で正規化したものとして定義します。振り子の固有特性 (回転剛性や減衰係数など)、xo1、xmax、xr、vin、vout に基づいて K を計算します。
   4. 変位は減衰した調和振動運動として説明できるため、指数関数的減衰関数を変位対時間曲線の最大値に当てはめます。
   5. Q(単位なし)を、振動振幅がeの係数で減少するために必要なサイクル数をπ掛けて計算します。Q値が高いほど、エネルギー散逸率が低くなります。

材料