レオメトリーを用いたマウス脳組織の粘弾性特性の測定

要約

出典: Canovic, E. P., et al.原子間力顕微鏡、衝撃インデンテーション、およびレオメトリーを使用した脳組織のマルチスケールの機械的特性の特性評価。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、レオメータを使用して、脳組織に制御された振動回転運動を適用してせん断ひずみを発生させ、組織の粘性および弾性特性を評価しました。レオメータは、機能的なツールとして、怪我や神経変性疾患の際の脳の力学に関する洞察を提供します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. レオロジー
   1. レオメータのセットアップと校正は、メーカーの指示に従って行ってください。
      1. レオメータを初期化するには、デバイス/コントロールパネルを開きます。コントロールパネルタブで、「初期化」をクリックします。
      2. 直径25mmの測定プレート(PP25)とサーマルシステムを取り付けます。
      3. (オプション)レオメータプレートとティッシュとの間の滑りを減らすために、上部のレオメータプレートの形状に一致する粘着性のサンドペーパースライスを切り取り、サンドペーパーを上部と下部のプレートに接着します。
      4. コントロールパネルの「ゼロギャップを設定」をクリックして、上部プレートと下部プレートを接触させます。
      5. 「Reset Normal Force」をクリックして、垂直抗力トランスデューサをゼロにします。
      6. イナーシャ試験は、制御盤のサービスタブを開き、「測定システム」→「イナーシャ試験」をクリックして行ってください。新旧の慣性を記録します。慣性が、製造元がリストしているプローブの許容範囲内にあることを確認します。
2. サンプルをレオメータにロードします。
   1. 組織を採取し、ブタの脳の冠状部分を~5 mmの厚さにスライスした後、CO2に依存しない培地で氷上に保存します。
   2. 2つのプレートの間に脳を置きます。滑りを防ぐために、サンプルの上面と下面から大きな水滴を取り除きますが、サンプルを乾燥させないでください。
   3. プレートが組織の上面に完全に接触し、5〜10分の緩和期間後に測定された垂直抗力が0.01mNで一定になるまで、測定プレートをゆっくりと下げます。
      1. コントロールパネルで、測定位置ボックスに連続して低い高さを入力し、「測定位置」をクリックして測定プレートをゆっくりと下げます。
      2. 組織との接触から1ミリメートル以内で、プレートが組織の上面に完全に接触するまで、測定プレートを0.1mm刻みで下げます。測定された垂直力が、5〜10分の緩和期間後に一貫して0.01 mNにあることを確認します。
      3. 最初に測定された垂直抗力を記録します。同じ圧縮応力 / ひずみで繰り返し測定を行う必要があります。
   4. サンプルがプレートの直径を超える場合は、プラスチックブレードでトリミングします。サンプルの端に少量(~1〜2 ml)の培地をピペットで移し、組織を水分補給します。
   5. (オプション)サーマルフードを下げます。コントロールパネルで、温度を37°Cに設定し、「設定」をクリックします。
3. 振幅スイープを実行して、対象の周波数 (、つまり 対象の周波数 (、たとえば、 1 rad/sec) で G' と G'' が一定であるせん断ひずみ) を確立します。
   1. 「ファイル/新規」を選択します。gelタブで、「Amplitude sweep: LVE-range」を選択します。ウィンドウを選択し、「Measurement 1: Amplitude sweep」をクリックします。振動ボックスをダブルクリックします。初期ひずみと最終ひずみ(など、 0.01〜105)、周波数(、例えば 1 rad/sec)、および10年あたりのポイント数(、例えば 6ポイント/dec)を入力します。「OK」を選択し、「開始」をクリックします。
   2. この手順をいくつかのスライスに対して繰り返し、試行を繰り返して、線形弾性範囲の一貫性を確保します。サンプルの軸方向の圧縮は、サンプル間で一定に保たれる必要があります。
4. 組織の線形粘弾性範囲のひずみ(など、1%ひずみ)と、関心のある周波数範囲(、例えば、0.1〜100 rad/sec)で、組織の周波数スイープを行います。
   1. 「file/new」をクリックし、ゲルタブで「Frequency sweep」を選択します。Window/Measurement 1: Frequency sweep をクリックします。振動ボックスをダブルクリックします。周波数範囲(、例:、0.1〜100 rad/sec)、ひずみ(、例:、1%ひずみ)、および10年あたりのポイント数(、例:、6ポイント/dec)を入力します。「OK」を選択し、「開始」をクリックして周波数スイープを開始します。
5. 周波数スイープ(ステップ1.4)を重複または三重に繰り返します。

レオメータによって自動的に計算され、エクスポートされるデータを確認します: G' と G" を周波数 (周波数スイープ) またはせん断ひずみ (振幅スイープ) の関数として。注: G' と G'' は、サンプルの (最大) 反トルク振幅 T'0 と、加えられた振動ひずみに対するサンプルの応答の回転変位角 (または偏向角) φ°、位相遅れ φ から計算されます (図 1 ):

ここで、R とh はサンプルの半径と高さです。

結果

Figure 1.平行平板レオメータの実験図。(A)平行平板レオメータ実験の概略図と、印加振動せん断ひずみに関する定義。(B)代表的な適用ひずみと結果として生じる応力(時間の関数)。せん断蓄積弾性率G'とせん断損失弾性率G"は、ひずみ振幅φ°、トルク振幅T'0、位相遅れφ、プローブとサンプル半径R、およびサンプル高さhを介して計算されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キシラキシン	ロイド研究所		処方薬
ケタミン	ケタミン{{}}{{}}AnaSed注射剤		処方薬
休眠剤-A Medium	Gibco	A1247501	成人組織用のCO2非依存性神経培地
平行平板レオメータ MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	直径25mmの平尺プレート
粘着紙やすり	McMaster-Carr	4184A48	代替サプライヤー使用可能
Loctite 4013 瞬間接着剤	ヘンケル	20268	代替サプライヤー使用可能