動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
分析用LA-ICP-MSの準備
- 標準試料とサンプルをアブレーションチャンバーに置き、LAユニットに取り付けられたCCDカメラの被写界深度内にあることを確認します。機器のチューニングが必要な場合は、適切な標準物質(例:NIST 612 Trace Elements in Glass)を含めてください。チャンバードアの2本のネジを指で締めて、アブレーションチャンバーを密閉します。
- ICP-MSソフトウェアで、「メンテナンス」または同様のパネルでアルゴンガスバルブを開くことを選択し、適切なダイアログボックスでキャリアガス流量を1.2 L min-1に設定します。
注:このプロトコルでは、アルゴンがキャリアガスとして使用されます。いくつかの例では、ヘリウムまたはヘリウムとアルゴンの混合物をキャリアガスとして使用します。 - LAソフトウェアで、「パージ」ボタンをクリックして、セルをアルゴンガスで最低30分間洗い流します
注:パージ時間は、「パージ時間」または同様のボタンをクリックして変更できます。2容量のアブレーションセルを備えたアブレーションシステムを使用する場合は、ステージを定期的に各コーナーに移動し、セルを斜めに横切って、セルからできるだけ多くの残留空気が除去されるようにします。これは、「ホームステージ」または同等の機能を選択することで実現できます。 - 「プラズマオン」をクリックしてICP-MSをオンにし、2時間ウォームアップすると、ステップ1.5〜2.4を実行できます。機器の設定はメーカーによって異なります。
- 組織標準液の代表的なアブレーション
- ラインツールを選択し、組織表面を横切る長さ約3mmのアブレーションの一本の線を引きます。
- 実験リスト内のアブレーションの線を右クリックし、次のようにパラメータを設定します:ビーム径(ユーザーが必要に応じて選択し、ここでは30 μmの正方形のビームを使用)、スキャン速度(ビーム径/秒の4倍、120 μm s-1)、エネルギーフルエンス(軟組織の場合は0.3 -0.5 J cm-2、必要に応じて硬いマトリックスに最適化)。組織の厚さが30 μmの場合、レーザービームはこの組織の全厚さを透過しないため、顕微鏡サポートから潜在的な汚染物質が排除されます。カーボンへの正規化は、アブレーションされる組織の量のばらつきを補正するために使用できます。これらのパラメーターを後続の各行のデフォルトとして設定するには、「default」ラジオボタンを選択します。
- 最初の行を選択し、右クリックして「重複スキャン」を選択することで、この行を6回複製します。線がビームの直径によって X 軸または Y 軸にオフセットされていることを確認してください。これにより、規格ごとに合計7本のラインが、ビーム径に応じて間隔を空けて配置されます。
- 各規格について手順1.5.1〜1.5.3を繰り返し、ラインの長さが同じであることを確認します。
- サンプル上にアブレーション領域を描画するには、次の2つの方法のいずれかに従います:
注:サンプルラインに同じスキャンパラメータ(ビーム径、スキャン速度、エネルギーフルエンス)が使用されていることを確認してください。- LAシステムが広い視野を備えている場合、ラインツールを選択し、1.5で概説したのと同じレーザーパラメータを使用して、サンプルの最も広い点をカバーするのに十分な長さのサンプルの左上隅から線を引きます。1.5.3で概説されているように、サンプルの完全なカバレッジを確保するために、ビーム直径に応じて必要な回数だけ間隔を空けた線でこのスキャンを複製します。
- ワイドフィールドビューが利用できない場合は、サンプル全体を覆う長方形の角に対応するx座標とy座標(通常はメイン画面に「ステージ位置」などとして表示されます)を決定して記録します。これらの座標を使用して、サンプル領域全体をカバーするアブレーションの平行線を配置します。
- 遅くとも ~20 時間後にサンプルをスキャンした後、1.5 で説明されているプロセスを繰り返すことにより、標準を断続的にスキャンするための線を引きます。サンプルのスキャン時間によっては、これが複数回必要になる場合があります。標準試料の追加スキャンで実験を終了します
注:セルがパージされている間にx座標とy座標を決定する場合、ホームポジションを選択し、軸の関連するキャリブレーションを行うと、以前に取得したx座標とy座標の詳細が変更されますが、差(つまり、ラインの長さ)は影響を受けません。
2.ICP-MSのデータ収集方法の設定
- アブレーションの標準ラインの場合、ラインの長さをレーザースキャン速度で割ると、1つのラインの合計分析時間が得られます。横断抽出ラインについてもこれを繰り返します。
- ICP-MS ソフトウェアで、新しいメソッド(ここでは「バッチ」と表示)を作成し、「時間分解分析」または同等の分析が選択されていることを確認します。検出するm/z値を選択し、各m/zの積分時間を調整して、1サイクルの合計積分時間が0.25秒になるようにします。「Save Batch As」をクリックし、それに応じて名前を付けます(例:Std1).
注:サンプルはビーム直径の4倍でレーザービームを横切るため、これにより、各質量のデータポイントがビーム直径と同等に記録されます。たとえば、100 μmのスポットサイズを使用して、スキャン速度を400 μm s-1、積分時間を0.25秒にすると、真のピクセルサイズの画像が生成されます。統合時間を調整して感度を向上させることができます。積分時間を0.33秒に増やす場合は、スキャン速度をビーム径の3倍に遅くする必要があります。 - 標準試料については、各ラインスキャンの分析時間を適切なボックスに入力し、さらにレーザーのウォームアップ時間とウォッシュアウト時間を考慮して15秒を追加で入力します。サンプルランリスト(スキャンの実行順序)を同じアクイジション数(通常は順番に番号が付けられる)で入力します。つまり、001、002など)を標準行の総数として使用します。
- サンプルについては、現在のメソッドまたはバッチを別のファイル名で保存して標準に使用したメソッドを複製し、サンプルをアブレートするラインの数に一致するように合計取得時間(追加の15秒を含む)と合計取得数を調整します。
注:ほとんどのLA-ICP-MSシステムは一方向トリガー(LAトリガーICP-MS)を使用しているため、 ICP-MSソフトウェアは、次のアブレーションラインが始まる前に、LAからのトリガーを待っていることが不可欠です。ICP-MS 取り込みウィンドウに「waiting for start」と表示されます。
3. 実験の実行
- 最初のメソッドまたはバッチをキューに追加してICP-MSキューを開始し、ソフトウェアがLAシステムからのトリガーを待っていることを確認します。
- LAソフトウェアで、「エミッション」をクリックし、「実行」をクリックしてレーザー電源を有効にし、適切なボックスでレーザーのウォームアップ時間を10秒に、ウォッシュアウト時間を20秒に設定します。
注:このオーバーランにより、レーザーがアブレーションの各ラインを開始するときに、ICP-MSが新しいデータの取得を開始する準備が整います。 - 「開始」をクリックしてレーザーシーケンスを開始します。2ボリュームセルを使用する場合は、サンプルカップが所定の位置にあることを確認してください。
4. 定量標準の計算
注:ICP-MSデータを画像に変換するには、複数のバリエーションがあります。これには、オープンソース言語で書かれた自家製のソフトウェアツール、商用マクロ、データ分析ソフトウェアの使用が含まれます。ここでは、専用のLA-ICP-MSデータ解析スイートに基づいて、最近開発されたソフトウェアプラグインを使用します。
- ランデータ(001.d、002.dなど)を含むすべてのバッチフォルダを、解析ソフトウェアがインストールされている別のコンピューターに転送します。バッチの各行の *.csv データ ファイルを別々のフォルダに抽出します。
注: スクリプトを使用して *.csv ファイルを新しいフォルダに自動的に転送することを強くお勧めします。詳細については、添付の Python コードを参照してください。このスクリプトは、Agilent 7700 または 8800 シリーズ ICP-MS に適合するように作成されていますが、他のメーカーの出力ファイルに合わせて編集できます。 - ソフトウェアプラットフォームを開き、タブを順番にたどって、以下で説明するように標準をインポートおよび分析して、定量的な画像を生成します。
- 最初の標準バッチからデータをインポートするには、「ファイルタイプ」に「Agilent .csv」を選択し、「インポートタイプ」に「フォルダ全体」を選択し、「日付形式」がコンピュータ形式と同じであることを確認してください。「インポート」をクリックし、最初の標準セットの.csvファイルを含むフォルダを選択して、「ベースライン」タブに移動します。
- ベースライン減算
- ツールバーのメインアプリケーションのドロップダウンメニューから「自動選択」タブ（コマンド2）を使用し、「インポートからの情報」を選択して「続行」をクリックしてください。
- 「Select All」をクリックし、統合のために「Baseline_1」を選択します。
- 各スキャンラインの最初の10秒(レーザーウォームアップ時間に対応する)を選択するには、2番目の値「0」と「(ラインの持続時間 - 10秒)」を入力してデータをトリミングし、「統合を追加」をクリックします(たとえば、35秒のスキャンラインの場合は、値「0」と「25」を入力します)。
- サンプルデータを選択するには、4.4で説明されているように「自動選択」タブを使用しますが、統合として「Output_1」を選択します。各標準ラインの始点と終点からデータをクロップして、バックグラウンド信号を除外します (例: 35 秒のスキャン ラインの場合は、値 '13' と '4' を入力します)。
- 標準試料の穴の可能性によって引き起こされる信号の低下を除外するには、[サンプル]タブで、グラフ領域の左上にある[チャンネル]をクリックして、信号対雑音比が高いチャンネル(C13やP31など)を選択します。信号の急激な低下をメモし、サンプル内の通常の変動よりも低いが、信号の急激な低下を拾い上げるのに十分な高さのCPS値を選択します。
- [DRS] タブをクリックし、[Current Data Reduction Scheme] で [Baseline_Subtract] を選択します。「Index Channel」は4.6からチャンネルを、「Threshold to use when masking low signals」はCPS値を選択します。「低信号の前後をトリミングする秒数」に <0.5 秒の値を挿入して、レーザーから ICP-MS への信号転送の遅延を考慮します。
- 低信号領域の適切なマスキングを確認するには、「Samples」タブに戻り、処理済み(Fe56_CPSなど)チャネルトレースを選択します。必要に応じて、CPSと4.7のように「Seconds to trim before/after low signals」の値を繰り返して調整します。
- 「結果」タブをクリックし、メインアプリケーションのドロップダウンメニューから「データのエクスポート」を選択します。ファイル名を入力して、結果のスプレッドシートデータファイルを生成します(例:Std1計算、Std2...)。
- 適切なスプレッドシートプログラムでデータファイルを開き、定量する個々のチャネルのCPS値を計算します。溶液噴霧ICP-MSから所定の金属濃度を使用して、定量可能な各元素のCPS値からppm(μgg⁻¹)への変換係数を計算します。
- 実行のすべての標準セットについて、手順 4.3 から 4.10 を繰り返します。
5. 定量的な画像の構築
- コマンドプロンプトで「Biolite()」と入力すると、ソフトウェアが開きます。
- 「Load Images」をクリックし、サンプル画像の.csvファイルを含むフォルダを選択して、サンプルデータをインポートします。
- 背景補正
- 「ベースライン」タブをクリックして、サンプルの背景補正を適用してください。画面に表示されるリン(P31)画像で、長方形の描画ツールを使用して背景の領域を選択します。できるだけ多くの領域を選択することで、シグナル/プラズマドリフトの画像全体のマップが作成され、これらの交絡因子から適切に補償されます。
- 背景信号を見やすくするには、グラフ編集ツール (表示されている画像の左上) を選択し、画像を右クリックします。「画像の外観を変更」を選択し、「Z=の最初の色」を大きな負の値(-100,000など)に変更します。「完了」をクリックして続行します。
- 「標準」タブをクリックして、CPS / ppm補正係数の表を表示します。各要素について、ステップ 4.10 の標準から計算された値を入力します。このステップは、ICP-MSの感度ドリフトを補正するのに役立ちます。「Go!」をクリックします。
- 「データ」タブから「データブラウザ」を開くと、各要素と各ステップの画像が保持されます。
- エクスポートするイメージをファイナライズするには、「StdCorrImages」フォルダで目的のイメージを選択し、イメージ名(*_ppm)を右クリックして「NewImage」をクリックします。画像を右クリックして「画像の外観を変更」を開き、目的のカラーテーブルとカラースケールを選択します。画像を右クリックして[注釈の追加]を選択し、画像にカラースケールを追加します。左上のドロップダウンメニューから[ColorScale]を選択し、タブを使用して目的のカラースケールを変更します。
- 画像をエクスポートするには、問題の画像が選択されていることを確認し、[ファイル]タブに移動して[グラフィックを保存]をクリックします。目的の形式を選択し、画像を保存します。または、選択した画像をコピー&ペーストツールを使用して転送することもできます。
- 目的のすべての画像について、手順 5.6 と 5.7 を繰り返します。
- 離散領域の定量化
- ROIツールを有効にするには、「分析」タブの「パッケージ」に移動し、「画像処理」を選択してください。
- 目的の画像を選択し、[画像]タブに移動して[ROI...]をクリックします。「ROI描画の開始」をクリックし、描画ツールを使用してサンプル内の関心領域を選択します。描画を終了するには、「ROIを終了」をクリックします。
- 選択したROIの統計を取得するには、[画像]タブに移動し、[統計]をクリックします。
- 結果をコピーして別のスプレッドシートに貼り付けます。対象のすべての領域と要素に対してROI選択(5.9.2)を繰り返します。
