ラットモデルにおける第2高調波発生イメージングによるチューブリン欠損の研究

要約

出典:Piazza, V., et al., Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin.J. Vis. Exp. (2023)

このビデオでは、ラットの脳組織切片の微小管異常を2光子励起顕微鏡でイメージングする手順を説明しています。第2高調波発生(SHG)信号を使用して、チューブリンの欠陥を検出し、ミエリン産生を減少させます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.顕微鏡に移す

1. 顕微鏡が別の部屋にある場合は、温めたジェルパックが入った断熱ボックスを用意して、温度を維持しながら組織切片を移します。また、ボックスは、画像化されるまでセクションを暖かく保ちます。
2. サンプルを顕微鏡の下に置き、透過光で接眼レンズを直接観察することにより、サンプルが対物レンズの下に適切に配置されていることを確認します。
   注: 目標は、予測された発光構造をレーザーの振動方向に合わせ、放出される (したがって検出される) 第 2 高調波発生 (SHG) 信号を最大化することです。
3. 余分なHBSSを取り除き、薄い液膜がサンプル全体を覆うようにします。サンプルの過度の蒸発と乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視で確認します。
   注: 記載されている条件下では、セクションは20分以内に使用されます。サンプルを乾燥させると、(図1A)に劇的なアーティファクト効果が生じます。より長いイメージング時間が必要な場合は、HBSSを追加するのではなく、切片を温かく新鮮な培地に定期的に浸すことをお勧めします。また、長時間の実験を行う場合は、灌流チャンバーと接着剤または低融点アガロースを使用して組織を固定することも推奨されます。
4. 顕微鏡ステージをノンデスキャンイメージング用に準備します。これには、暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉めるか、インキュベーションチャンバーを黒色のナイロンポリウレタンコーティング生地で覆うなどが含まれます。

2. イメージング

1. 伝送経路に沿って「ノンデスキャン」イメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。
2. LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA対物レンズを選択します。
3. レーザー出力を 13 mW から 26 mW の間で設定し、ピクセル滞留時間を 12.6 μs に設定します。512 ピクセル x 512 ピクセル以下の画像を、速度 5、平均 2 で、平均取得時間約 15 秒で撮影します。
   注: レーザー出力を高くしたり、滞留時間が長かったりすると、サンプルが損傷する可能性があります (図 1B )。
4. 最初に485 nmショートパスフィルター(SP485)を使用して画像を撮影し、2番目のステップでシャープな405 nmバンドパスフィルター(BP405;図2)。
   注: 擬似明視野画像は、可視線の残留レーザー光を使用して同じ検出器で撮影できます (405 nm または 488 nm レーザーが最適です)。

結果

図 1: アーティファクトの例。(A)サンプルの乾燥によるアーティファクト。(B)過度の露出によるアーティファクト。スケールバー:30 μm.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
405/10 nm BrightLine(R) シングルバンドバンドパスフィルター	Semrock	FF01-405/10-25	直径32 mm、ハウジングリング付き
ブラックナイロン、ポリウレタンコーティング生地	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) 厚さ
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM710NLO AxioObserver Z1	倒立顕微鏡、使用対物レンズはLCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Hanks'Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076	粉末から調製可能
NDDモジュール、 タイプ C	ツァイス	00000-1410-101	信号を検出し、光の損失を減らすため。000000-1935-163フィルターセットとSP485
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco	10010-031	粉末またはタブから調製可能
パルスレーザー	コヒーレント	カメレオンビジョンII	680–1080 nmチューナブルレーザー