マウス網膜外植片における神経細胞樹状細胞ダイナミクスのタイムラプス共焦点イメージング

要約

出典:Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations.J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用して、生きたマウス網膜外植片の樹状突起ダイナミクスを視覚化する方法を示します。共焦点顕微鏡で網膜を安定化する手順、スターバーストアマクリン介在ニューロンを視覚化するための落射蛍光イメージングの実施、およびアマクリン樹状突起形態の変化を監視するためのタイムラプス3D画像のキャプチャの手順を概説します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

ライブホールマウント網膜調製物のタイムラプス共焦点イメージング

1. 図1.
   注:倒立共焦点システムの場合、フラットマウントは、インキュベーションチャンバーのガラス底カバースリップに直接網膜神経節細胞(RGC)側を下にして配置されます。網膜がカバーガラスに接触すると、網膜を動かすことはできません。
2. チャンバーに酸素化人工脳脊髄液(aCSF)を充填し、ポンプと温度コントローラーをオンにします(温度32-34°C、流量1mL /分)。温度が34°Cを超えないようにしてください。
3. レチナールフラットマウントを灌流チャンバーに移すには、ポンプを停止し、チャンバー内にあるaCSFを取り外します。混合セルロースエステル(MCE)ディスクをレチナールフラットマウントで(空の)インキュベーションチャンバーに入れます。
4. サンプルウェイトをフラットマウントに置き、ウェイトを事前に濡らして表面張力を壊します。温めた aCSF をチャンバーに補充し、aCSF を ~1 mL/分で循環させます。
5. ノーズピースを25倍水浸対物レンズ(開口数0.95)でイメージングチャンバーに配置します。脱毛蛍光を用いて標識した目的細胞をスクリーニングします(図1C)。
6. 
   注:この研究では、フレームあたり1024 x 1024ピクセル、zステップ1μm、および各zスタック間のフレームレート2分で完全な樹状突起をキャプチャしました。最終的な画像サイズは、~100 μm x 100 μm x 20 μm です。
7. レーザー出力を最適な設定に調整するには、過飽和ピクセルと低飽和ピクセルの両方を識別するルックアップテーブルを使用します。スキャン中は、ピクセルが過飽和にならないように(つまり、強度が255以上になるように)レーザー出力を調整します。必要な限り、または蛍光シグナルの有意かつ検出可能な減少とノイズの増加(通常は2-4時間)があるまでイメージングを続けます.
   注:デコンボリューションアルゴリズムは、ピクセルが全ダイナミックレンジに分布しているときに最適に機能するため、レーザー出力を減らすことをお勧めします。ピクセル強度は 254 を超えないようにする必要があります。神経突起の実証分析により、170未満のピクセル値がデコンボリューションに理想的であることが明らかになりました。高速スキャン速度(400〜600 Hz)とライン平均化(2〜3)は、同じ合計ピクセル滞留時間の単一の低速スキャンよりも望ましいです。長時間のイメージング領域では、しばしば光色が現れますが、他の外植片切片は依然として生存可能です。フラットマウント内の複数の領域を、それぞれ2〜4時間、合計6時間のインキュベーション時間でイメージングできます。6時間を超えるイメージングセッションは体系的にテストされていません。神経突起の劣化とブレブは、外植片の生存率が低下している兆候です。

結果

図1:生細胞イメージングインキュベーションチャンバーのセットアップ。(A)加熱、溶液、およびイメージングコンポーネントを示すライブイメージングインキュベーション装置。デュアルヒーターには、加熱されたインキュベーションチャンバープラットフォーム(青いコネクタ電極を備えたバックサークル)とインライン溶液ヒーターが含まれています。(B)1Aの概略図。MCEメンブレン(灰色)上のレチナールフラットマウント(赤)をインキュベ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
混合セルロースエステル膜(MCE)濾紙、親水性、孔径0.45μm	Millipore	HABG01 300
ポリエチレン使い捨てトランスファーピペット	VWR	470225-034
チャンバーポリエチレンチューブ、PE-160 10'	ワーナーインスツルメンツ	64-0755
デュアルチャネルヒーターコントローラー、モデルTC-344C	ワーナーインスツルメンツ	64-2401
HC FLUOTAR L 25x / 0.95 W VISIR浸漬対物レンズ	カ	15506374
ヒーターコントローラーケーブル	ワーナーインスツルメンツ	CC-28
大型バスインキュベーションチャンバー付きスライスサポート	ワーナーインスツルメンツ	RC-27L
MPII ミニ蠕動ポンプ	ハーバード装置	70-2027
PM-6D 磁気加熱プラットフォーム (インキュベーションチャンバーヒーター)	ワーナーインスツルメンツ	PM-6D
ポンプヘッド チューブピース MPII ミニ蠕動ポンプ	ハーバード装置	55-4148
サンプルアンカー (ハープ)	ワーナーインスツルメンツ	64-0260	サンプルアンカーは、インキュベーションチャンバーと互換性がある必要があります
Slofloインラインソリューションヒーター	ワーナーインスツルメンツ	SF-28
カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C7902
カルボゲン(5%CO₂、95%O₂)	エアガス	X02OX95C2003102	サプライヤーは地域
によって異なります D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES、遊離酸	バイオ塩基性	HB0264
塩酸溶液、1 N	Sigma-Aldrich	H9892
塩化マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	M2670
pH テスト ストリップ (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
カリウム塩化物 (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
NaClBio	Basic	DB0483
リン酸ナトリウム 一塩基性	Sigma-Aldrich	RDD007
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	オープンソース

ライ用 塩化