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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1.ヒト嗅覚被覆グリア(ihOEG、Ts12、Ts14)培養
注:この手順は、組織培養バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で行われます。
- ME10 OEG 培地 50 mL を調製します。
- 15 mLのコニカルチューブに、5 mLのダルベッコの改変イーグルミディアムまたはDMEM / F12-ウシ胎児血清(FBS)を調製します。.
- 両方の培地を37°Cのきれいな水浴で15分間温めます。
- Ts12およびTs14細胞バイアルを清水浴中で37°Cで解凍します。
- ステップ2で調製したDMEM/F12-FBS培地に細胞を再懸濁し、加えます。
- 200 x gで5分間遠心分離します。
- 上澄みを熱望します。
- ME10培地500μLを加え、ペレットを再懸濁します。
- 3 mLのME10を含むp60細胞培養皿を調製し、細胞懸濁液を滴下します。
- 細胞をプレート全体に均一に分布させるために移動します。
- 細胞を37°Cで5%COで培養します2.
注:コンフルエンスに達した後、共培養のために細胞を最適化するために、少なくとも別の継代を行う必要があります。共培養のためにカバースリップに播種する前に、90%のコンフルエンスが必要です。コンフルエントなp-60の平均細胞数は、Ts14では7 x 105、Ts12細胞株では2.5 x 106です。Ts12およびTs14細胞株は、2〜3日ごとに継代する必要があります。
2.アッセイのためのihOEG(Ts12およびTs14)の準備
注:このステップは、網膜神経節ニューロン(RGN)の解剖および共培養の24時間前に行う必要があります。
- 12 mm Øカバーガラスを10 μg/mLポリ-L-リジン(PLL)で1時間処理します
注:カバーガラスはPLL溶液に一晩放置できます。 - カバーガラスを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。
- Ts12およびTs14 ihOEG細胞をp60細胞培養皿から分離します。
- 15mLのコニカルチューブに4mLのDMEM/F12-FBS培地を追加してください。きれいな水浴で37°Cで温めます。
- 培地をプレートから取り出し、1mLの1x PBS-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で細胞を1回洗浄します。
- 1 mLのトリプシン-EDTAをOEG細胞に添加し、37°C、5%CO2で3〜5分間インキュベー
トします。- p1000ピペットで細胞を採取し、ステップ3.1で調製した培地に移します。
- 200 x gで5分間遠心分離します。
- 上澄みを熱望します。
- ME10培地1mLを加え、ペレットを再懸濁します。
- 血球計算盤で細胞数を数えます。
- 80,000 Ts14 細胞または 100,000 Ts12 細胞/ウェルを 500 μL の ME10 培地中の 24 ウェルプレートのカバースリップに播種します。
- 細胞を37°Cで5%CO2で24時間培養します。
3.網膜組織解剖
注:生後2か月の雄のWistarラットがRGNソースとして使用されます。24ウェルセルディッシュの20ウェル用の2つの網膜(1匹のラット)。使用前にオートクレーブ手術用材料。パパイン解離キットは市販されています(材料の表)。プロバイダーの指示に従って再構成します。D、L-2-アミノ-5-ホスホ吉草酸(APV)を5 mMストックに再構成し、アリコートを調製します。
- アッセイ当日は、次のメディアを準備してください。
- 5 mLの冷たいEarle's Balanced Salt SolutionまたはEBSS(パパイン解離キットのバイアル1)でp60細胞培養皿を調製します。
- パパイン解離キットの再構成バイアル2(パパイン)と50μLのAPVでp60細胞培養皿を調製します。次に、再構成したバイアル3 250 μL (DNase と 5 μL の APV) を加えます。
- 滅菌チューブ内で、2.7 mLのバイアル1と300 μLのバイアル4(アルブミン-オボムコイドプロテアーゼ阻害剤)を混合します。150 μL のバイアル 3 (DNase) と 30 μL の APV を加えます。
- 20 mLのNeurobasal-B27培地(NB-B27)を調製します。.
- ネズミをCO2で窒息死させます。
- ギロチンで頭を斬首し、100 mmのシャーレに入れ、70%エタノールをヘッドにスプレーしてから、層流フードに入れます。
- ネズミのひげをハサミで切って、目の操作を妨げないようにします。
- 鉗子で視神経をつかみ、メスで目を切開できるほど眼球を引き抜きます。
- 水晶体と硝子体液を取り除き、網膜(オレンジ色のような組織)を引き出しますが、目の残りの層(色素上皮層を含む)は内側にとどまります。
- ステップ3.1.1で調製したp60細胞培養皿に網膜を置きます。
- ステップ3.1.2で調製したp60細胞培養皿に網膜を移し、メスで約1mm<小片に切断します。
- 15mLのプラスチックチューブに移します。
- 加湿インキュベーターで37°C、5%CO2の下で組織を30分間インキュベートし、10分ごとに攪拌します。
- ガラス製のパスツールピペットでピペッティングを上下させて、細胞の凝集体を解離します。
- 細胞懸濁液を200 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、パパインを不活性化するために、ステップ3.1.3で調製した溶液に細胞ペレットを再懸濁します。(2眼で1.5mL)。
- この細胞懸濁液を5mLの再溶解バイアル4に慎重にピペットで移します。
- 200 x gで5分間遠心分離します。
- 遠心分離中に、ME-10培地をOEG 24ウェルセルプレート(ステップ2で調製済み)から完全に取り出し、ウェルあたり500 μLのNB-B27培地と交換します。
- 上清を捨て、細胞を2 mLのNB-B27培地に再懸濁します。
- m24プレートのウェルごとに100μLの網膜細胞懸濁液をPLL処理またはOEG単層カバースリップにプレートします。
- NB-B27培地で5%CO2を含む37°Cで96時間培養します。
4. 免疫染色
- 96時間後、1x PBS中の同量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1x PBSに添加して細胞を10分間固定します(PFA最終濃度2%)。
- 24マルチウェルプレートから培地とPFAを取り出し、1x PBSに500 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を再度加えます。10分間インキュベートします。
- 固定具を廃棄し、1x PBSで5分間3回洗浄します。
- 0.1% Triton X-100/1% FBS を PBS (PBS-TS) で 30–40 分間ブロックします。
- SMI31(MAP1BおよびNF-Hタンパク質に対して)モノクローナル抗体(1:500)、514(MAP2AおよびBタンパク質を認識する)、ウサギポリクローナル抗血清(1:400)で、PBS-TS緩衝液に一次抗体を調製します。
- 一次抗体を共培養に添加し、4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、抗体を廃棄し、カバーガラスを1x PBSで3回、5分間洗浄します。
- 次のようにPBS-TSバッファーで二次抗体を調製します:SMI-31の場合、抗マウスAlexa Fluor 488(1:500)。514の場合、アンチウサギAlexa-594(1:500)。
- 対応する蛍光二次抗体と細胞を室温で1時間、または暗所でRTでインキュベー
トします。- カバースリップを1x PBSで3回、5分間、暗闇で洗います。
- 最後に、封入剤(材料表)でカバースリップをマウントし、4°Cに保ちます.
注:必要に応じて、DAPI(4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)による蛍光核染色を行うことができます。マウントする前に、DAPI(1x PBSで10 μg/mL)を使用して、暗所で細胞を10分間インキュベートします。カバースリップを1x PBSで3回洗浄し、最後に封入剤でカバースリップをマウントします。
5. 軸索再生の定量化
注:サンプルは、落射蛍光顕微鏡の40倍対物レンズで定量されます。各治療で定量化するために、少なくとも 200 個のニューロンを含むランダム フィールドで少なくとも 30 枚の写真を撮影する必要があります。各実験は最低3回繰り返す必要があります。
- RGN の全集団 (ニューロン本体と樹状突起の MAP2A/B 514 陽性免疫染色で同定) に対する軸索 (SMI31 陽性神経突起) を持つニューロンの割合を定量化します。
- 軸索再生指数または平均軸索長(μm/ニューロン)を定量化します。このパラメータは、同定されたすべての軸索の長さ(μm)の合計を、軸索を示したかどうかに関係なく、カウントされたニューロンの総数で割ったものとして定義されます。軸索の長さは、画像ソフトウェアImageJ(NIH-USA)のプラグインNeuronJを使用して決定されます。
- 適切なソフトウェアを使用して、平均、標準偏差、および統計的有意性を計算します。