全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞イメージング

Abstract

出典:Daniele, F., et.al SH-SY5Y 神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞ダイナミクスを評価するための TIRFM および pH 感受性 GFP プローブ: 細胞イメージングとデータ解析.J. Vis. Exp.(2015).

このビデオでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してヒト神経芽腫細胞をイメージングし、蛍光色素でタグ付けされたシナプス小胞を可視化する方法を示します。細胞は最初に落射蛍光モードで焦点を合わせます。次に、全反射を達成するための調整が行われ、膜近くの蛍光色素を選択的に励起するエバネッセント波が生成されます。TIRFイメージングの前に、アクイジションパラメータを設定し、サンプリング周波数を設定します。

Protocol

1. 細胞培養とトランスフェクション

1. SH-SY5Y 細胞培養
   注: 実験はヒト神経芽腫 SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) を用いて行っています。SH-SY5Y細胞は、浮遊クラスターと接着細胞の混合物として増殖します。プロトコールで報告されている指示(細胞密度、分裂率など)に従って、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)にとって重要なガラスカバーに成長する細胞をしっかりと付着させます。
   1. 開始する前に、層流バイオセーフティキャビネットの下で、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液と培地の適切な量を作ります。
      1. 150 mM塩化ナトリウム(NaCl)、24 mMリン酸緩衝液、pH 7.4の濃度で50 mlのPBSを作成します。溶液をフィルタリングします。
      2. 高グルコース、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U / ml)、ストレプトマイシン(100 μg / ml)、L-グルタミン(2 mM)、およびピルビン酸ナトリウム(1 mM)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)から50 mlの細胞培地を調製します。溶液をフィルタリングします。
   2. 増殖培地全体を取り出し、細胞を3mlのPBSで洗浄します。
   3. 細胞を2 mLの0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(6 cmシャーレ用)と5分間インキュベートし、37°C、5% CO_2,で5分間インキュベートし、ピペットを使用して細胞を分離します。
   4. 2 mLのDMEMを添加してトリプシンを不活性化し、300 x gで5分間遠心分離して細胞を回収します。
   5. 上清を除去し、ペレットに1 mlのDMEMを加え、溶液をピペットで上下させて細胞を単一細胞懸濁液に分散させます。
   6. それらを1:4 mmの完全な培地を含む新しい直径3cmのシャーレで3:3に分割します。直径6 cmのシャーレ内の細胞を37°Cで5% CO₂インキュベーターで培養します。週に一度、または表面積の80〜90%をカバーしたときにサブカルチャーを行います。
2. イメージング用SH-SY5Yセルプレート
   1. TIRFM実験用、プレートセルをガラスカバーに載せます。厚さ0.17±0.005mm、屈折率1.5255±0.00015のガラスカバーをご使用ください。始める前に、次のようにガラスカバースリップを準備します:
      1. ガラスカバーを90%エタノールで一晩(O / N)洗浄します。
      2. 蒸留水で十分にすすいでください(蒸留水は3回交換します)。乾燥オーブンでガラスを覆います。
      3. ガラス製のシャーレにカバーを入れ、予熱したオーブンで200°Cで3時間滅菌します。
   2. トランスフェクションの前日、各カバースリップを3.5 cmのシャーレに入れ、1 mLの培地を加え、5% CO₂インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
   3. ステップ1.1.3〜1.1.5で説明したように細胞をトリプシン処理し、細胞ペレットを1 mLの完全培地に懸濁し、カウントします。各ペトリ皿に追加する細胞懸濁液の正しい量を計算して、3 x 10⁵細胞/ウェルを生成します。この密度は、最適な細胞増殖と効率的なトランスフェクションに必要です。5% CO₂インキュベーターO/Nで37°Cでインキュベートします。
3. SH-SY5Yポリエチレンイミン(PEI)によるトランスフェクション
   注: シナプス小胞のダイナミクスを可視化するために、シナプト-pHluorinを含むpCB6ベクターが使用されています。シナプト-pHluorinは、緑色蛍光タンパク質(GFP)のpH感受性変異体と小胞膜タンパク質シナプトブレビン2のインフレーム融合によって生成されました。このコンストラクトは、ニューロン内のシナプス小胞特性を調査するために広く採用されています。
   1. トランスフェクションを開始する前に、以下の溶液を10 mL調製してください。ソリューションは最大1か月間保管してください。
      1. 150 mM NaCl溶液を調製します。0.01 N塩酸(HCl)でpH 5.5に調整します。
      2. 150 mM NaCl溶液中に10%ポリエチレンイミン(PEI;25 kDa直鎖状)でPEI溶液を作製します。溶液のpHは8.8に上昇します。めっき後24時間後、0.01N HClでpHを7.8に調整します。
   2. }}めっき後24時間後、培地を取り出し、1.5mlの完全培地でリフレッシュします。細胞を5% CO₂インキュベーターで37°Cに保ちます。
   3. 層流バイオセーフティキャビネットの下の1.5 mLマイクロチューブに、3.5 cmシャーレあたり25 μlの150 mM NaCl溶液と100 μlのPEI溶液に3 μgのプラスミドDNAを加えます。
   4. 10秒間ボルテックスした後、DNA/PEI混合物を室温(RT)で30分間インキュベートします。
   5. 細胞の入ったカバースリップが入ったシャーレにDNA/PEI混合物を慎重に加え、シャーレ内の試薬を均等に分配するように静かに振とうします。
   6. 4時間後、培地を交換し、5% CO₂インキュベーターで細胞O/Nを37°Cでインキュベートします。トランスフェクションの24〜48時間後にイメージング実験を行います。

2. TIRFMによる細胞イメージング

1. イメージングセットアップ
   1. 図1で説明されているセットアップでTIRFイメージングを実行します。電動倒立顕微鏡(図1、挿入図A)、レーザー光源(図1、挿入図B)、TIRFスライダー(図1、挿入図C)で構成されています。高開口数(NA 1.45 Alpha Plan-Fluar)100倍油、浸漬対物レンズを通じてTIRFM照明に到達します。
   2. TIRFM照明には、マルチライン(458/488/514 nm)100 mWアルゴンイオンレーザーを使用します。モノモードファイバーを使用して、TIRFスライダーを介して直線偏光レーザー光をビームパスに導入します。TIRFスライダーを反射光ビーム経路の光場ダイアフラム面に挿入します。
      1. 広視野照明の場合は、顕微鏡を従来の水銀短アークランプHBO白色光に接続します。スライダーの偏光保持ダブルプリズムにより、TIRF照明と白色光の同時組み合わせが保証されます。
   3. フィルターホイールに取り付けられた励起フィルター(帯域幅488/10 nm)でレーザー光をフィルタリングし、レーザー光路に導入します。ソフトウェア制御の高速シャッターを採用し、レーザー照明の高速制御を可能にします。pHluorin分析には、バンドパス525/50 nm蛍光フィルターを取り付けます。Image ProPlusソフトウェアを使用して、冷却されたFast CCDカメラでデジタル画像(512 x 512ピクセル)をキャプチャします。
2. TIRF 照明の達成 (図 2)
   1. レーザー、コンピューター、カメラ、フィルター ホイール、シャッター コントローラーをオンにします。その後、レーザーがウォームアップして安定する必要があるため、実験を開始する前に20分待ちます。
   2. イメージングする前に、次の溶液の適切なボリュームを作成してください。
      1. 125 mM NaCl、5 mM 塩化カリウム (KCl)、1.2 mM 硫酸マグネシウム (MgSO₄)、1.2 mM リン酸二水素カリウム (KH₂PO₄)、25 mM 4-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-1-エタンスルホン酸 (HEPES) (pH 7.4 に緩衝)、2 mM 塩化カルシウム (CaCl₂)、 および6 mMグルコース。
      2. 80 mM NaCl、50 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、25 mM HEPES(pH 7.4に緩衝)、2 mM CaCl₂、および6 mMグルコースで10 mLのKCl-KRH溶液(pH 7.4)を調製します。
   3. トランスフェクションした細胞の入ったガラスカバーを取り外し、適切なイメージングチャンバーに挿入します。チャンバーを組み立て、ガラスの中央に500 μlのKRH溶液を加えます。
   4. 対物レンズにオイルを追加します。イメージングチャンバーを顕微鏡のステージに置き、対物レンズをガラスカバースリップの下に配置します。安全カバーをサンプルの上に置きます。
   5. 落射蛍光モードでは、カバーガラス(上面)にピントを合わせ、チャンバー中央に配置されたトランスフェクション細胞を選択します。80ミリ秒未満の露光時間で蛍光シグナルを明瞭に記録できる細胞を選択します。
   6. ソフトウェア制御下で、ライブモードでTIRF照明に切り替えます。
   7. TIRF 構成を設定するには、対物レンズから出るビームの位置をサンプル カバーで確認します (図 2Bビームが対物レンズの中央に配置されると(図2A、左)、TIRFサンプルカバーの中央にスポットが見え(図2B、左)、細胞は落射蛍光モード(いくつかの焦点面、高バックグラウンド蛍光;図 2C, 左)。
   8. 臨界角度に達するには、焦点を合わせたスポットをY方向(前方または後方)に移動します。図2B、中央)をTIRFスライダーの角度調整ネジを使用して(図1C)。ビームが臨界角よりも大きな角度で試料平面に収束すると(図2A、右)、スポットは消え、試料カバーの中央に直線的で細い焦点の線が見えます(図2B、右)。
   9. TIRF角度を微調整するには、セルサンプルを使用します(図2C)。ビデオの蛍光画像をご覧ください。この段階では、落射蛍光のような画像がまだ見えます。TIRF状態が達成されるまで、ネジを静かに動かします:セルの1つの光学面のみに焦点が合っています(つまり、カバーガラスと接触している原形質膜)。これにより、コントラストの高いフラットな画像が得られます (図 2C、右
3. サンプルイメージング
   1. シングルチャンネルのタイムラプス実験を設定します。光退色を最小限に抑えるには、低露光時間と高ゲインで画像を撮影します。適切な露光時間は40〜80ミリ秒です。1 - 2 Hzのサンプリング周波数で画像を取得します。小胞の動力学は、より高い周波数(10 Hz)でサンプリングする方が評価しやすい場合があります。通常の観測時間は通常2分です

Results

図 1.TIRF顕微鏡のセットアップ。TIRF顕微鏡システムの概略図と画像(挿入図)。このセットアップは、Axio Observer Z1電動倒立顕微鏡(A)、マルチライン100mWアルゴンイオンレーザー(B)、TIRFスライダー(C)で構成されています。レーザー光(緑の線)と白色の光(黄色の線)が示されています。細胞は、100 ×油浸対物レンズを使用してイメージングされます。デジタル画像は、冷却されたRetigaSRV Fast CCDカメラでキャプチャされます。リフレクター...

Materials