全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞イメージング

Abstract

出典:Daniele, F., et.al SH-SY5Y 神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞ダイナミクスを評価するための TIRFM および pH 感受性 GFP プローブ: 細胞イメージングとデータ解析.J. Vis. Exp.(2015).

このビデオでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してヒト神経芽腫細胞をイメージングし、蛍光色素でタグ付けされたシナプス小胞を可視化する方法を示します。細胞は最初に落射蛍光モードで焦点を合わせます。次に、全反射を達成するための調整が行われ、膜近くの蛍光色素を選択的に励起するエバネッセント波が生成されます。TIRFイメージングの前に、アクイジションパラメータを設定し、サンプリング周波数を設定します。

Protocol

1. 細胞培養とトランスフェクション

1. SH-SY5Y 細胞培養
   注: 実験はヒト神経芽腫 SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) を用いて行っています。SH-SY5Y細胞は、浮遊クラスターと接着細胞の混合物として増殖します。プロトコールで報告されている指示(細胞密度、分裂率など)に従って、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)にとって重要なガラスカバーに成長する細胞をしっかりと付着させます。
   1. 開始する前に、層流バイオセーフティキャビネットの下で、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液と培地の適切な量を作ります。
      1. 150 mM塩化ナトリウム(NaCl)、24 mMリン酸緩衝液、pH 7.4の濃度で50 mlのPBSを作成します。溶液をフィルタリングします。
      2. 高グルコース、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U / ml)、ストレプトマイシン(100 μg / ml)、L-グルタミン(2 mM)、およびピルビン酸ナトリウム(1 mM)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)から50 mlの細胞培地を調製します。溶液をフィルタリングします。
   2. 増殖培地全体を取り出し、細胞を3mlのPBSで洗浄します。
   3. 細胞を2 mLの0.05%....

Results

図 1.TIRF顕微鏡のセットアップ。TIRF顕微鏡システムの概略図と画像(挿入図)。このセットアップは、Axio Observer Z1電動倒立顕微鏡(A)、マルチライン100mWアルゴンイオンレーザー(B)、TIRFスライダー(C)で構成されています。レーザー光(緑の線)と白色の光(黄色の線)が示されています。細胞は、100 ×油浸対物レンズを使用してイメージングされます。デジタル画像は、冷却されたRetigaSRV Fast CCDカメラでキャプチャされます。リフレクター.......

Materials