マウスの子犬線条体における遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

要約

出典: Chen, S., et al., Stereotacic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、Cre組換え酵素と緑色蛍光タンパク質またはGFPをコードするウイルスベクターを遺伝子組み換えマウスの子犬の線条体に定位注射し、loxP-frunkedのSTOPカセットを切除し、赤色蛍光タンパク質またはRFPをレポーターとして活性化することにより、遺伝子操作を達成する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロインジェクション

1. : 定位固定装置を 70% エタノールで完全に拭いて、無菌手術を準備します。手術器具を70%エタノールに浸して滅菌します。
2. 子犬の頭を70%エタノールでこすります。頭蓋骨のランドマークラムダを見つけ、マーカーペンでラムダに印を付けます。針先をラムダに向け、前後 (AP) と内側外側 (ML) 座標をゼロに設定します。
3. ターゲット部位のX座標とY座標に従って、注入アームをターゲット部位に移動します。生後日 (P) 2 匹の子犬の線条体の場合、座標は AP、ラムダの前方 +2.4 mm。ML、正中線から外側±1.0 mm。背腹側(DV)、頭蓋骨から-1.7 mm。PE10チューブ内の高速緑色染料の位置をペンでマークします。
4. 30Gの注射針をゆっくりと下ろして皮膚と頭蓋骨を貫通し、頭蓋骨の表面で止まるまで針先を持ち上げます。DV 座標を 0 に設定します。
5. 30G注射針がターゲット部位のDV座標に達するまでゆっくりと下ろします。実質が通常の形状に戻るまで1分間待ちます。次に、マイクロインジェクションプログラム(100 nL/分)を実行します。
6. ウイルス液が脳に確実に注入されるように、高速緑色染料のマークがPEチューブ内で移動していることを確認してください。
7. マイクロインジェクションの終了後1分間待ってから、30秒以内にゆっくりと徐々に針をDV深さの1/2の高さまで持ち上げます。30秒後、子犬の頭からゆっくりと針を引き抜きます。

2.子犬の術後の回復

1. 子犬を33°Cのインキュベーターで20分間温めます。子犬が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、5分ごとに低体温麻酔からの子犬の回復を確認します。
2. 子犬が完全に回復したら、子犬をダムに戻します。

材料