マウスの子犬線条体における遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

要約

出典: Chen, S., et al., Stereotacic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、Cre組換え酵素と緑色蛍光タンパク質またはGFPをコードするウイルスベクターを遺伝子組み換えマウスの子犬の線条体に定位注射し、loxP-frunkedのSTOPカセットを切除し、赤色蛍光タンパク質またはRFPをレポーターとして活性化することにより、遺伝子操作を達成する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロインジェクション

1. : 定位固定装置を 70% エタノールで完全に拭いて、無菌手術を準備します。手術器具を70%エタノールに浸して滅菌します。
2. 子犬の頭を70%エタノールでこすります。頭蓋骨のランドマークラムダを見つけ、マーカーペンでラムダに印を付けます。針先をラムダに向け、前後 (AP) と内側外側 (ML) 座標をゼロに設定します。
3. ターゲット部位のX座標とY座標に従って、注入アームをターゲット部位に移動します。生後日 (P) 2 匹の子犬の線条体の場合、座標は AP、ラムダの前方 +2.4 mm。ML、正中線から外側±1.0 mm。背腹側(DV)、頭蓋骨から-1.7 mm。PE10チューブ内の高速緑色染料の位置をペンでマークします。
4. 30Gの注射針をゆっくりと下ろして皮膚と頭蓋骨を貫通し、頭蓋骨の表面で止まるまで針先を持ち上げます。DV 座標を 0 に設定します。
5. 30G注射針がターゲット部位のDV座標に達するまでゆっくりと下ろします。実質が通常の形状に戻るまで1分間待ちます。次に、マイクロインジェクションプログラム(100 nL/分)を実行します。
6. ウイルス液が脳に確実に注入されるように、高速緑色染料のマークがPEチューブ内で移動していることを確認してください。
7. マイクロインジェクションの終了後1分間待ってから、30秒以内にゆっくりと徐々に針をDV深さの1/2の高さまで持ち上げます。30秒後、子犬の頭からゆっくりと針を引き抜きます。

2.子犬の術後の回復

1. 子犬を33°Cのインキュベーターで20分間温めます。子犬が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、5分ごとに低体温麻酔からの子犬の回復を確認します。
2. 子犬が完全に回復したら、子犬をダムに戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Hamilton MICROLITER シリンジ	Hamilton	80300	30G 針は PE10 チューブに適合します。26G 針には PE20 アダプターが必要です
エチレン チューブ PE20	ベクトンディキンソン	427406
ポリエチレンチューブPE10	クトンディキンソン	427401
マイクロフローレートシリンジポンプ	ングプレシジョンポンプ株式会社	TJ-2A(コントローラー)およびL0107-2A(ドライブユニット)
25Gシリンジ	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.10%
標準定位装置	RWD Life Science	68037	68030マウス/新生児ラットアダプターLSM
880共焦点顕微鏡	Zeiss	LSM 880
AAV9.hシナプシン.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	クターコア	AV-9-PV1848	ット#CS0987、5.506x1013(GC / mL)
B6。Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	ジャクソン研究所	7914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2TM1.1Sfis/CFREJ	ジャクソン研究所	26259	Foxp2fl/fl

ポリベロペンベロ