エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

Abstract

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオでは、皮質ニューロンのエキソサイトーシスイベントを視覚化するための全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示します。pH感受性緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカーは、小胞融合時に蛍光を発し、選択的TIRF励起により、タイムラプスイメージングで膜近位エキソサイトーシスを捕捉します。

Protocol

1. 全反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるエキソサイトーシスイベントのイメージング

注

:このプロトコルには、温度、湿度、および二酸化炭素(CO₂)を維持するための環境チャンバー、落射蛍光照明を備えた倒立全反射蛍光(TIRF)顕微鏡、高倍率/高開口数(NA)TIRF対物レンズ、自動XYZなどの特殊な顕微鏡装置が必要ですステージ、および高感度電荷結合素子(CCD)検出器。このプロトコルは、100x 1.49 NA TIRF対物レンズ、固体491 nmレーザー、および電子増殖CCD(EM-CCD)を備えた全自動倒立顕微鏡を使用します。すべての機器は、イメージングおよびレーザー制御ソフトウェアによって制御されます。イメージングプロトコルを開始する前に、環境チャンバー、ステージ、ランプ、コンピューター、およびカメラの電源を入れます。

1. イメージングソフトウェア内で対物レンズを選択します。対物レンズを所定の位置に設置したら、対物レンズヒーターをカラーに固定します。
2. ステージインキュベーターをステージスロットに固定する前に、対物レンズが完全に下がっていることを確認してください。こぼれを防ぐために、蒸留水をステージインキュベーターの入口に均等に注ぎます。
3. インキュベーションシステムをオンにします。CO₂ タンクのバルブを開き、製造元の指示に従って圧力がシステムに適切であることを確認します。チャンバーが5%CO

Materials