エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

Abstract

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオでは、皮質ニューロンのエキソサイトーシスイベントを視覚化するための全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示します。pH感受性緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカーは、小胞融合時に蛍光を発し、選択的TIRF励起により、タイムラプスイメージングで膜近位エキソサイトーシスを捕捉します。

Protocol

1. 全反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるエキソサイトーシスイベントのイメージング

注

:このプロトコルには、温度、湿度、および二酸化炭素(CO₂)を維持するための環境チャンバー、落射蛍光照明を備えた倒立全反射蛍光(TIRF)顕微鏡、高倍率/高開口数(NA)TIRF対物レンズ、自動XYZなどの特殊な顕微鏡装置が必要ですステージ、および高感度電荷結合素子(CCD)検出器。このプロトコルは、100x 1.49 NA TIRF対物レンズ、固体491 nmレーザー、および電子増殖CCD(EM-CCD)を備えた全自動倒立顕微鏡を使用します。すべての機器は、イメージングおよびレーザー制御ソフトウェアによって制御されます。イメージングプロトコルを開始する前に、環境チャンバー、ステージ、ランプ、コンピューター、およびカメラの電源を入れます。

1. イメージングソフトウェア内で対物レンズを選択します。対物レンズを所定の位置に設置したら、対物レンズヒーターをカラーに固定します。
2. ステージインキュベーターをステージスロットに固定する前に、対物レンズが完全に下がっていることを確認してください。こぼれを防ぐために、蒸留水をステージインキュベーターの入口に均等に注ぎます。
3. インキュベーションシステムをオンにします。CO₂ タンクのバルブを開き、製造元の指示に従って圧力がシステムに適切であることを確認します。チャンバーが5%CO₂および37°Cに達するまでしばらく待ちます。イメージングディッシュを追加する前に、対物レンズへの水の結露を避けるために、空のディッシュをインキュベーターに入れます。
4. レーザー光源の電源を入れます。
5. ステージインキュベーターを開き、レンズに浸漬油を加えます。サンプルをインキュベーターに入れ、スタビリティアームまたはディッシュウェイトで安定させます。オイルがサンプルの底に接触するまで対物レンズを持ち上げます。透過光照明に切り替えて、接眼レンズを通してニューロンの焦点面を見つけます。
6. レーザーソフトウェアを起動し、レーザー制御ソフトウェアに接続します。照明を広視野に設定し、対物レンズを選択します(100x 1.49 NA TIRFを推奨)。サンプルの屈折率を設定します(セル~1.38)。491nmレーザーの「TTL」(トランジスタ-トランジスタロジック)のチェックを外して、レーザー強度を調整します。スライダーを 100 に調整してから、20% から 40% の間の値に戻します。「TTL」に再度チェックを入れます。
7. 透過光照明でサンプルに再び焦点を合わせます。イメージングソフトウェアに移動し、491 nmレーザー照明を選択し、シャッターを開きます。天井のレーザーの焦点を微調整し、コンデンサーを取り外した状態で閉視野ダイヤフラムの中心に合わせます。レンズを傷つけないように、コンデンサーを光学ベンチに逆さまに置きます。
8. コンデンサーを交換し、TIRFソフトウェアに移動し、浸透深さ(PD)を110nmに設定します。次に、イメージングのために広視野照明からTIRF照明モードに切り替えます。
9. 落射蛍光光源による広視野落射蛍光を使用して、小胞関連膜タンパク質2(VAMP2)-フルオリン発現細胞を眼を通して見つけます。
   最小露
   1. 光時間とレーザー強度を使用して、イメージングパラメータ(露光時間、ゲイン、レーザー出力)を調整して、光退色と光毒性を低減します(たとえば、50〜100ミリ秒の露光、最大レーザー出力30%で15〜30ゲイン)。
   2. セルごとに連続オートフォーカスを設定します。0.5秒ごとに取得するタイムラプス画像セットを5分間取得します。netrin-1刺激条件では、層流フード内の細胞のディッシュに500 ng / mlのnetrin-1を加え、イメージング前にディッシュをインキュベーターに1時間戻します。

Materials