動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 記録注入ピペットの組み立て
- 長さ約7cmのガラス毛細管(外径1mm)をピペットプーラーで引っ張ります。
- 毛細管の先端を壊し、光学顕微鏡で開口部を確認します。内径が30μm〜40μmであることを確認します。
- ガラスピペットの先細りのない端から約1cm突き出た長さ7cmの銀線をガラスキャピラリーに挿入します。
- 余分なフィラメントをガラス毛細管に直交して曲げます。
- 30 G皮下注射針のシャフトに柔軟なプラスチック接着剤の液滴を塗布します。
- 図1に示す回路図に従って、ガラスピペットに30 Gの皮下注射針を挿入します。
- ガラスピペットと皮下注射針の間の接合部から適切に密閉されるように、接着剤の2番目のコーティングを追加します。
- 接着剤が適切に硬化するように、先端を上に向けてピペットを約 12 時間乾燥させます。完成した結果を図2に示します。
注:この手順は急性実験で行われ、ピペットチップの滅菌は必要ありません。
2. 動物の準備
:
- ラットを麻酔箱に入れます。
- 4%イソフルランを使用して5〜10分間麻酔を誘発します。
体- 温を37°Cに維持するために、加熱パッドと直腸プローブを備えた定位固定テーブルに動物を置きます。ノーズコーンを使用して、2%イソフルランで麻酔を維持します。イヤーバーと歯のホルダーを使用してネズミの頭を固定します。
- 瞳孔散大を助けるために、1%アトロピン点眼薬を含む眼科用軟膏または点眼薬を塗布します。乾燥を防ぐために、約30分ごとに潤滑液を塗布してください。
- 頭を剃り、10%ポビドンヨードできれいにします。
- 局所麻酔の場合は、皮膚を持ち上げて針先を挿入して、頭皮の下に2〜3か所の2%リドカイン0.5mlを注射します。
- つま先をつまんで動きがないことを観察して、適切なレベルの麻酔を確認します。さらに、心拍数を監視して、正常値(300〜400拍/分)内にあることを確認します。
- #10メスの刃で正中に沿って頭皮を一直線に切開し、冠状縫合糸と矢状縫合糸の両方を露出させます。
- 頭蓋骨を覆っている組織を外科用ヘラで押しのけて、ラムダポイントとブレグマポイントを明らかにします。
- ブレグマとラムダの位置が同じ平面上になるように頭蓋骨を水平
にします。- 基準点を設定するには、ガラス管が取り付けられた定位固定装置を使用して、ブレグマの真上に設定します。これは、前後および内側外側の測定座標の「ゼロ」になります。
- 定位固定マウントを必要な座標に移動して関心点を設定し、定位座標をメモし、開頭術が行われる場所を示すターゲット領域の周囲に正方形を描きます。
滅- 菌ドリルビットを備えた外科用ドリルを使用して、マークされた正方形に沿って圧力をかけずにゆっくりと使用し、骨材料をゆっくりと取り除きます。同じ領域に長時間穴を開けすぎると、熱が発生して皮質に病変が生じるので注意してください。
- 開頭術を区切る骨が十分に薄くなったら、ピンセットで頭蓋部分を慎重に取り除き、皮質を露出させます。
- 組織の乾燥を防ぐために、露出した皮質を人工脳脊髄液で頻繁に洗浄します。
注:インジェロードの先端は貫通するのに十分な強度があるため、ラットでは硬膜の除去は不要です。
3. 注入システムの充填と取り付け
- 5-10 μl のマイクロシリンジに鉱物油を吸引して充填します。
- 固定ガラスピペットに、0.5%シカゴスカイブルー(CSB)と300μMのγ-アミノ酪酸(GABA)の溶液、または2%リドカインと0.5%CSBの溶液で皮下注射針を満たします。すべての溶液を生理食塩水で希釈します。
- 物質が豊富な場合は、通常の注射器を使用して充填し、気泡の形成を避けるために通常の予防技術を使用してください。
- より高価な物質の場合は、鉱物油を使用してインジェクトロードを充填し、吸引によって化学薬品を導入することができます。鉱物油と水の密度差が比較的大きいため、この物質は水溶液の注入に適した候補です。
注:染料を添加して、2つの液体間の分離を確認できます。
- 注射ピペットを満たすには、吸引によって1mlのシリンジに溶液を充填し、溶液を注入ピペットにゆっくりと注入します。
- 図1に示す領域の漏れには細心の注意を払い、これらの領域をスワブできれいに拭き取り、シリンジで溶液をゆっくりと注入して漏れを観察します。
- 1mlのシリンジを取り外します。その際は、真空によって注入ピペットから溶液が除去されないように、プランジャーに軽い圧力をかけてください。
- 吸引によってマイクロシリンジに鉱物油を充填し、充填された注射ピペットにしっかりと取り付けてから、組み立てられたインジェクトロードから余分な溶液をガーゼで注意深く拭き取ります。
- ガラスピペットの先端に小さな液滴が形成されるのを見るのに十分な量の非常に少量を注入して、チップが詰まっていないことを確認します。
- インジェクタードをマイクロポンプシステムに取り付け、しっかりと固定されていることを確認します。
- インジェクトロードの先端をターゲット座標に慎重に配置し、先端を皮質の表面まで下げます。
- 適切な解剖学的座標を使用して、定位固定装置を使用してインジェクトロードをターゲット構造(この場合は上丘)までゆっくりと下げます。
- 組織の乾燥を防ぐために、露出した皮質を温かい寒天で覆います。
4. 注入と可逆的不活化
マイクロ
- インジェクションポンプを40 nl / minで400〜800 nl注入するように設定し、[実行]を押して注入を開始します。スパイク率は注射中に減少を示すことに注意してください。
注:実験セットアップでは、GABA送達の終了後1時間以内に神経活動が回復しました。校正された機械装置を使用して、注射を行うためにマイクロインジェクションシリンジに圧力を加えることができます。 - 電気生理学的データを取得した後、地元の動物倫理委員会によって承認された方法を使用して安楽死させます。
