遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

要約

出典: Tadokoro, T., et al.成体マウスにおける軟膜下アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオは、マウスの脊髄への遺伝子送達のための軟膜下注射技術を示しています。この手順には、硬膜を露出させ、軟膜に穿刺し、蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) を軟膜下腔に注射することが含まれます。注射と回収後、ウイルスは脊髄細胞での遺伝子発現を促進し、標的遺伝子発現の研究を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 一般的な動物および外科的準備

1. 外科的処置を開始する前に、ウイルスを解凍します (AAV9-UBI-GFP [UBI: UBIQUITIN PROMOTER, GFP: Green Fluorescent Protein]; 5 μL aliquots)。デキストラン粉末を蒸留水中に混合して、5%デキストラン(10,000 MW)溶液を調製します。ウイルス溶液を5%デキストラン溶液と1:1で混合し、最終デキストラン濃度を2.5%にします。
   1. ウイルス溶液を氷(4°C)に保存します。
2. 成体C57BL / 6Jマウス(雄と雌、20〜30 g)を使用します。5%イソフルラン(O₂、1 L / min)を使用してマウスを麻酔し、呼吸数と足のピンチ反応に応じて、手術中にノーズコーンで2〜3%吸入イソフルラン(O₂、1 L / min)でマウスを維持します。
3. シェービングバリカンで動物の背中を剃り、2%クロルヘキシジンで皮膚をきれいにします。
4. 慢性回復研究では、厳格な無菌技術に従ってください。
5. 腰椎軟膜下注射を行う場合は、Th8-L1椎骨を重ねた皮膚をメスで切断し、ハサミを使用してTh10-12脊椎から傍脊椎筋を剥離します。
   マウスの
   1. 脊椎クランプを使用して、動物を標準の定位固定フレームに取り付けます。
   2. Th10-12椎骨の椎板の両側を歯科用ドリル(ドリルビット:0.9 mm、速度:20,000 rpm)を使用して、ひび割れが現れるまで剃ります。
   3. 鉗子でひびの入った骨片を取り除き、腰椎脊髄の背側表面を露出させます。
   4. 1 Gのステンレス鋼の針と鉗子を使用して、硬膜を約30 cm切り開きます。

2. 軟膜膜を開き、AAV9デリバリー用の軟膜下針を挿入

する

1. ガラスキャピラリーホルダーを使用して、34 G軟膜貫通針をXYZマニピュレーターのZアームに取り付けます(図1AおよびB)。
   注:軟膜貫通針を製造するために、34G針の元の面取りされた先端は、ダイヤモンド研磨板を備えたガラス毛細管ベベラーを使用して研ぎます-粗い(5.0μm〜50μmの先端サイズ)と15〜20°の研削角度。次に、針の先端(長さ1 mm、先端から測定)を約90°にゆっくりと曲げます(図1B、左インサート)。
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2. 〜10倍の倍率に設定された外科用解剖スコープを使用して、Xアームを使用して軟膜貫通針で軟膜を約1 mm(図1C)貫通します。
   組織
   1. 表面に対する貫通針の角度を5〜10°に保ちます。
3. 軟膜開口部後、Xアームを使用して軟膜下腔(図1D)から軟膜を貫通する針を水平に取り外します。
   注:血管などのランドマークによって貫通された部位を覚えておいてください。
4. PE-10またはPE-20チューブで注射針に接続された50μLマイクロシリンジを使用して、AAV9-UBI-GFPウイルスを鈍い36G注射針にロードします。
5. ガラスキャピラリーホルダー(図1B、右インサート)を使用して、針を2番目のXYZマニピュレーター(図1AおよびB)のZアームに取り付けます。
   注:軟膜下AAV9注射針を製造するには、36 G針の鈍い先端をダイヤモンド研磨プレートを備えたガラスキャピラリー面取り機を使用して研磨し、粗い(5.0μm〜50μmの先端サイズ)鋭いエッジを取り除きます。次に、針の先端(長さ2〜3 mm、先端から測定)を約90°にゆっくりと曲げます。軟膜を貫通する注射針と軟膜下注射針を長さ1〜2 cmの20Gスレーブステンレス鋼チューブ(針の端から10 mm)に挿入し、エポキシで接着します。ガラスキャピラリーホルダーにしっかりと取り付けるには、20 G(直径0.91 mm)のチューブを使用する必要があります。
6. 第2マニピュレーターのX、Y、およびZアームを操作することにより、AAV9注射針の先端を軟膜貫通部位に配置し、Xアームを使用して前の軟膜膜開口部を通って軟膜下腔に約2〜3mm前進させます(図1EおよびF)。
   注:1)AAV9-UBI-GFPは、以前に報告されたプロトコルに従って調製されます。 最終力価は1.2 x 10¹³ゲノムコピー/mL(gc / mL)に調整されます。2)軟膜開口部は容易に識別できるため、マーキングする必要はありません(図1D)。
7. 50 μLマイクロシリンジを使用して、AAV9-UBI-GFP(1.5、3、または5 μL)を軟膜下腔に注入します(実験グループについては表1を参照)。
8. AAV9-UBI-GFP注射が完了したら、軟膜下腔から注射針を取り外します。
9. 4.0モノフィラメント縫合糸と外科用クリップを使用して筋肉と皮膚を閉じます。
   注:開いた椎骨を密閉する必要はありません。
10. 動物を加熱パッドの上で回復させます。
11. 疼痛管理のために、ブプレノルフィン 0.05 mg/kg/sc を術後 2-3 日間 12 時間ごとに注射します。

表1:実験グループ。 すべての実験は、成体C57BL / 6Jマウスで実施されました。

<図 class='table'>

実験グループ	AAV9 送達の部位/レベル (*)	AAV9 注入量、注入速度	生存時間	組織分析
グループ A (n = 7)	C2 (両側)	5 μL/5 分	14 日	脳 + 脊髄
グループ B (n = 12)	L1-L2 (両側)	1.5 μL または 3μL、60 秒/μL	14 日間	脳 + 脊髄
グループ C (n = 6)	C2 + L1-L2 (各レベルで両側)	5 μL/5 分	14 日間	脊髄
* - 両側 = 2 回の軟膜下注射、1 回は注射されたセグメントの右側に、もう 1 回は左側の軟膜下腔に送達されます。

結果

図1:成体マウスで脊髄軟膜下注射を行うための実験的セットアップ。(A)成体マウスに脊髄軟膜下注射を行うために、2つの別々のXYZマニピュレーター(IおよびII)が使用されます。(B)各マニピュレーターのZアームには、ガラスのキャピラリーホルダーが保持されています。1つの毛細管ホルダーは軟膜を貫通する34 G針を保持し、2番目の毛細管ホルダーは鈍い36 G軟膜下注射針を保持します。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J マウス	ジャクソン研究所	664
ラボ マウス用標準定位固定装置	バード装置	72-9568
マウス脊椎アダプター	ハーバード装置	72-4811
XYZ マニピュレーター	Stoelting	51604
手動輸液ポンプ	Stoelting	51218
34G 面取りナノフィル針	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G 鈍いナノフィル針	World Precision Instruments	NF-36BL-2
フルリソ、イソフルラン	MWI 獣医用品	502017
クロルヘキシジン溶液	MWI 獣医供給	501027
20G ステンレススチールニードル	Becton-Dickinson	305175
23G ステンレススチールニードル	Becton-Dickinson	305145
30G ステンレススチールニードル	Becton-Dickinson	305128
コットンチップアプリケータ	MWI 獣医用品	27426
ガラス キャピラリー ベベラー	ナリシゲ インターナショナル	SM-25B
スライド顕微鏡 スーパーフロスト	ライカ マイクロシステムズ	M80
50μl マイクロシリンジ	ハミルトン	81242
BD イントラメディック PE-20 チューブ	ベクトン、ディキンソン	427406
BDIntramedic PE-10 チューブ	Becton、Dickinson 427401
4-0 モノフィラメント縫合糸	VetOne	V1D397
ガラス キャピラリー ベベラー	Narishige	ピペット マイクロ グラインダー EG-40
5 分エポキシ (エポキシ クリア)	Devcon	14310
デキストラン	ポリサイエンス社	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD ウイルスベクターコア研究所

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