in vivoイメージングのためのマウスへの脊髄ウィンドウ移植

要約

出典: Pietruczyk, E. A., et al.マウスにおける椎弓切除術と脊髄窓移植J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオは、in vivo イメージングのために麻酔をかけたマウスに脊髄ウィンドウを移植する方法を示しています。このプロトコルは、ホウケイ酸カバーガラスと 3D プリントされたバックプレートを使用して、露出した脊髄を安定させます。この方法により、高解像度の二光子顕微鏡で血液脳関門のダイナミクスと神経血管相互作用を研究できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. カバーガラスの埋め込み

1. 露出したコードに 3 mm のホウケイ酸カバーガラスをそっと貼り付けます。
2. アガロースが39°Cに冷却されていることを確認します。小さなへらを使用して、温かい2%アガロース/ aCSF(人工脳脊髄液)をカバーガラスの端に塗布し、毛細管現象で表面の下に引き寄せます。
   注:39°C未満の温度では、アガロースがゲル化し始めることがあります。このような場合は、ウォーターバスまたは電子レンジを使用して再温めてください。一部のオペレーターは、最初にアガロースを1滴塗布し、カバーガラスを上に置きます。
3. 胸部レベル 11 の椎骨と胸部レベル 13 の椎骨の無傷の隣接椎骨の露出した骨関節突起に組織接着剤を塗布します。椎弓切除部位の周囲、隣接する腱と横突起の上に、リング状に追加の組織接着剤を塗布します。
   注:後続のステップで歯科用セメントに適切に接着するには、組織接着剤が必要です。関節突起は、バックプレートが安定して置かれることができる自然なシートを形成します(図1)。関節突起への接着は、最も強い付着点を形成します。
4. 歯科用セメントと促進剤を磁器ミキシングトレイで混合します。小さなスパチュラを使用して、歯科用セメントを組織接着層に転写します。歯科用セメントを使用して、バックプレートを窓の中央にある手術野に接着します。歯科用セメントが硬化するまで10分待ちます。
   注:バックプレートが前部および後部の関節突起にしっかりと接着することで、インプラントの基本的な構造的安定性が得られます。
5. 追加の歯科用セメントを使用して、バックプレートの内側のベースとバックプレートの下側を埋めます:組織界面。
   注:歯科用セメントの追加塗布は、接着性を向上させ、顕微鏡の対物浸漬液(生理食塩水)がバックプレートの底から漏れるリスクを低減します。
6. フォークバックプレートホルダーを窓の上の適切な位置に進めます。バックプレートをネジでバックプレートホルダーに固定します。
   注:このプロトコルは、カスタム機械加工されたバックプレートホルダーを利用しました(図2G \u2012H)。
7. バックプレートに生理食塩水を塗布して漏れをテストします。液体が漏れた場合は、その部分を乾燥させ、歯科用セメントをさらに塗布します。

2.イメージングの準備

1. 動物を手術プラットフォームの光学テーブルに移します。
   注:当社の手術プラットフォーム、バックプレートホルダー、およびイソフルランノーズコーンホルダーは、連続イソフルラン麻酔を適用しながら、1つのユニットとして手術用イメージングステーションと2光子イメージングステーション間を輸送できます(図2D、H).同様のユニットは、市販の供給元 (ThorLabs など) から入手できる保持フォーク、ビーム、および支持柱から組み立てることができます。生体内顕微鏡検査の場合、手術プラットフォームの高さに対応するために、顕微鏡対物レンズと光学テーブルの間に少なくとも 11 インチのクリアランスが必要です。
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2. テンレス製の取り付けポストとザグリクランプフォークを使用して、手術台を光学テーブルに固定します。
3. バックプレートのウェルに新鮮な生理食塩水を塗布します。水浸レンズを井戸に降ろします。
4. 透過光または落射蛍光を使用して、関心のある領域と焦点を識別します。レーザースキャンモードに切り替え、組織内に存在する蛍光色素の適切な2光子レーザー励起波長、ダイクロイック、およびバンドパスフィルターに従ってin vivoイメージングを実行します6。

結果

図1.脊髄ウィンドウの解剖学的配置の概略図。A) 胸部下部椎体、棘突起、および脊髄 (sc) セグメントの上図の概略図。点線の円は、バックプレート接着の主な支持点である関節突起の座を示しています。B)脊髄ウィンドウの上図の概略図。標的椎骨(ここではT12)が取り除かれました。アガロースの薄い層が脊髄を覆っています。カバーグラスがアガロースの上に置かれています。組織接着剤は、横突起上に塗布されます(そして、ここに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dプリントされた楕円形バックプレート			安定化イメージングフィールド
用解剖顕微鏡	ライカ	M205 C	カFusionOptics、Planapo 0.63x Mシリーズ対物レンズ、グライディングステージ
を搭載顕微鏡カメラ	Leica	MC170	HDカラーカメラ 手術野を視覚化するためのHDカラーカメラ
グライカステージ	ライカ	10446301	グライディングステージは2枚の金属板で構成されています。ベースプレートは固定されています。上部プレートはグリースを塗った界面をスライドし、回転および直線運動を可能にします。
手術ステーションと安定化フォーク	Whale Manufactoring	カスタム	椎弓切除術
SomnoSuite 低流量イソフルランデリバリーユニット	Kent Scientific	SS-01	デジタル気化器内蔵の外科麻酔投与
ステンレススチール製 1.5インチ取り付けポスト	ThorLabs	P50/M	光子イメージング
用の光学テーブルへの手術ステーションの取り付け用1.5インチ取り付け用ザグリクランプフォーク ポスト	ThorLabs	PF175	2光子イメージング用の光学テーブルへの手術ステーションマウントを安定させるため
理想的な骨マイクロドリル	ハーバード装置	72-6065	椎弓切除術用骨の薄化
ウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック	15-462-10	加温生理食塩水
灼ガン	FST	18010-00	軽度の出血の焼灼
加熱パッド	ベンチマーク	BF11222	1.9インチ x 4.5インチシリコンヒーター、20インチテフロンリード、10W、5V
Kタイプ熱結合直腸プローブ	Physitemp	RET3	マウス体温測定
ワセリン	シグマ	8009-03-08	直腸プローブの潤滑
フィードバック調整式サーマルコントローラー	カスタム	NA	市販の代替品には、Physitemp TCATシリーズPVA
外科用アイスピアビー	バービジテックインターナショ	40400-8	血液
電動トリマーWahl		41590-0438	ミングマウスファー
ブレード、#11	FST	14002-14	器具
鉗子、#5	FST	11254-20	器具
鉗子、#4などがあります。	FST	14002-14	手術器具
チタニウム歯付き鉗子	WPI	555047FT	手術器具
チタンアイリスハサミ	WPI	555562S	手術器具
Vetbond 組織接着剤	3M	084-1469SB	歯科用アクリル用組織表面の準備
セラミックミキシングトレイ	Jack Richeson	420716	歯科用アクリル剤の混合促進剤付き
Orthojet歯科用アクリル	Lang Dental	1520BLK、1503BLK	組織への永久接着バックプレート
丸いカバーガラス、#1厚さ、3mm	ハーバード装置	64-0720	光学窓
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	aCSF
グルコース	フィッシャー サイエンティフィック	50-99-7	aCSF
HEPES	シグマ	7365-45-9	aCSF
MgCl₂・6H₂O	ッシャー サイエンティフィック	7791-18-6	aCSF
CaCl₂・2H₂O	ッシャー サイエンティフィック	#################	aCSF カル
プロフェン	リマジル	QM01AE91	鎮痛
静菌水	Henry Schein	2587428	カルプロフェン用希釈剤
ソフルラン	Henry Schein	11695-6776-2	麻酔
乳酸リンゲル液	Baxter	0338-0117-04	マウス用水和
ガロース ハイ EEO	シグマ	A9793	ゲルポイント 34-37 °C
科用潤滑軟膏	Akwa Tears	68788-0697	角膜乾燥防止
MOM 二光子顕微鏡	ッター

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