マウスモデルにおける脳浮腫を軽減するための受容体遮断薬の静脈内送達

要約

出典: Zeynalov, E. et al.、脳卒中誘発性脳浮腫を研究するためのマウスにおけるアルギニン-バソプレシン受容体遮断薬コニバプタンの選択治療経路は、持続IV注入です。J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオは、マウスモデルにおけるアルギニン-バソプレシン(AVP)受容体拮抗薬の静脈内送達を示しています。一過性の中大脳動脈閉塞は脳浮腫を誘発するAVP 受容体拮抗薬は、左頸静脈のカテーテルを介して投与され、浮腫が軽減されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. In Vivo 脳卒中導入

手術

1. 前にフィラメントを歯科用レジンでプレコートします。
   1. 7-0ナイロン縫合糸から長さ12mmのフィラメントを切り取ります。樹脂2部と硬化剤1部を混ぜ合わせ、すぐにフィラメントの先端を混合物に浸し、全長の約1/3を覆います。すぐに取り外し、滑らかな表面の歯科用レジンのコートで覆われていることを確認します。
   2. 使用前にフィラメントを2時間自然乾燥させてください。
2. マウスを麻酔導入チャンバー(2 L容量)に入れ、25%酸素が豊富な室内空気中の1.5%イソフルランの流量をチャンバーに入る2 L /分に設定します。
3. 尾のつまみに対する反応の欠如によって決定されるように、完全に麻酔されるまでマウスを誘導チャンバー内に留めます。
4. マウスを加熱パッドで手術台に置き、ノーズコーンから自発的に送達される麻酔を維持するためにイソフルラン濃度を1%に設定します。
5. 首の前後の髪をクリップし、消毒用アルコールを首にスプレーします。両目に動物用眼科軟膏を塗ります。
6. 体温を継続的に監視するには、手術中にデジタルディスプレイに接続された直腸温度プローブを使用してください。
7. マウスを仰臥位に置き、消毒のためにポビドンヨード10%スクラブ溶液を塗布し、滅菌ドレープで覆い、サイズ10の外科用メスの刃で首に沿って正中線を切開します。
8. 左総頸動脈(CCA)を6.0シルク縫合糸で一時的に結紮します。
9. 左外頸動脈(ECA)に別のネクタイを置きます。
10. 微小血管クリップを内頸動脈(ICA)に配置します。
11. 微小血管はさみで外頸動脈に小さな穴を開けます。歯科用レジンでコーティングされた7-0ナイロン縫合糸で作られたフィラメントをECAの開口部に挿入し、抵抗が感じられるまで(CCAの分岐点から約5〜7 mm)、クリップを取り外しながら頭側に前進させます。
12. 内頸動脈に一時的な結びつきを置き、フィラメントを所定の位置に固定します。図1Aを参照してください。シルク縫合糸で皮膚を閉じ、ステップ2.6のように0.5%ブピバカイン0.2mlで首の前の傷に浸潤させます。
13. マウスを麻酔から目覚めさせ、回復室で60分間意識を取り戻します。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
神経
14. 学的欠損スコアリング(NDS)についてマウスを次のようにテストします:0 =正常な運動機能、1 =テールリフト時の胴体と反対側前肢の屈曲、2 =反対側に旋回するが安静時は正常な姿勢、3 =安静時に反対側に傾く、4 =自発的な運動活動なし。
    1. NDSテストでは、マウスの尻尾を持ち上げて平らな面に置いて観察します(2〜3分)。あるいは、回復室でマウスを観察します。中頸動脈(MCA)の閉塞が不十分なため、NDSが2未満を示すマウスを実験から除外します。
       注:レーザードップラー流量測定技術を使用して、MCAの閉塞を確認できます。
15. 上記のように誘導チャンバーで60分間の回復後に動物を再麻酔し、10%ポビドンヨードスクラブ溶液で前の皮膚切開を再滅菌し、絹縫合糸を切断して除去することにより、首の前の手術創を再開します。
16. ECA からフィラメントを取り外すには、次の手順を実行します。
    1. ICA に微小血管クリップを置きます。ICAの縫合糸をほどき、クリップを開いたままフィラメントを引き出します。
    2. クリップを閉じて、ECAにカットの近位でタイを置きます。
    3. CCAからクリップと結紮糸を取り外して、脳への血流を回復します。図1Bの図を参照してください。

2. 静脈内 (IV) カテーテルの頸静脈への挿入による 48 時間の連続治療

注: マウスを目覚めさせずに、ステップ 1.16.3 の直後にカテーテルの挿入に進みます。

1. 2つの異なるサイズのフレキシブルチューブを使用します:内側のチューブ(外径0.94 mm、注入される薬物を封じ込めるため)を外側のチューブ(外径3.18 mm、内側のチューブを保護するため)に挿入します。
2. マウスを腹臥位に置き、消毒のために10%ポビドンヨードスクラブ溶液を塗布し、サイズ10の外科用メスの刃で首の後ろに1cmの切開を行います。マウスを仰臥位に回し、10%ポビドンヨードスクラブ溶液で首の前部を再滅菌し、首の前部の手術創を再開します。背中から首の前まで切開した部分から皮膚の下にチューブをトンネルし、開いた傷から1cm外側に穴を
開けます。
3. 正中線から横方向に約1cmの首の前部の左側から皮下脂肪組織を除去します。左頸静脈を見つけ、静脈に沿って5mm離して2本のネクタイを置き、静脈を少し伸ばします。微小血管はさみで2つのネクタイの間の頸静脈に小さな穴を開けます。インナーチューブの先端を尾側(心臓に向かって)深さ5mm挿入します。
4. 両方のタイでチューブを頸静脈に固定します。首の前の皮膚を3-0のシルク縫合糸で閉じます。図1Cの図を参照してください。
5. チューブを縫合糸で首の後ろの皮膚に固定し、チューブをスイベルを介してマイクロインフュージョン IV ポンプに接続します。スイベルにより、ケージ内でマウスが自由に動き、餌や水に完全にアクセスできます。
6. 術後の痛みを防ぐために、首の前面と後ろの皮膚切開部に0.2mlの0.5%ブピバカインを浸潤させます。
   注:施設固有の動物プロトコルに応じて、動物は術前および術後にオピオイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、または抗生物質で治療される場合があります。ただし、前述の治療法は虚血性脳卒中の結果を変化させる可能性があります。
7. 動物を回復室で目覚めさせ、実験の終点まで動物を別のケージに収容します。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
8. コニバプタン(5%ブドウ糖で0.14 mg / ml)またはビヒクルの連続48時間IV治療の注入速度を1.5 ml / kg / hrに設定し、注入を開始します。
   注:IV注入コニバプタンの総量は、総量1.44 mlで約0.2 mg /マウス/日でなければなりません。

結果

図1:脳卒中後48時間の実験的脳卒中モデル、IVカテーテルの設置、および代表的な梗塞量の図。 閉塞 (A) および再灌流時間 (B) 中の左内頸動脈 (ICA) に樹脂 (緑) で事前にコーティングされたフィラメント (青色で表示) の位置。左頸静脈(C)におけるフレキシブルチューブチップの正しい位置。マウスの実験的脳卒中は、48時間で同側半球に梗塞容積を生じます。マウス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
加熱パッド	K&H Manufacturing Inc	1060
直腸プローブ付き温度モニター	Physitemp	7029
シルク縫合糸スプール、6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
針にシルク縫合糸、3-0	Ethicon	1684G
ナイロン縫合糸、7-0	Ethicon	1696G
歯科用樹脂ポリシロキサン、硬化剤付き	Heraeus Kulzer	65817930
マイクロインフュージョン IV ポンプ	Kent Scietific	GT0897
スイベル 22GA	Instech	375/22PS
実験用チューブ、0.94 x 0.51 mm	ダウコーニング	508-002
用チューブ、3.18 x 1.98 mm	ダウコーニング	508-009

実験