マウスモデルにおけるグリア細胞リプログラミングのためのウイルスベクターの定位注射

要約

出典: Pereira, M. et al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Gial Cells into Interneurons by Intentrebral Injection of Viral Vectors.J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオは、トランスジェニックマウスの大脳皮質にアデノ随伴ウイルスを定位注射して、Cre依存性ニューロンのリプログラミングと蛍光レポーター遺伝子をグリア細胞に送達する方法を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.脳への再プログラミング因子の注入

1. 動物のセットアップ、定位固定配置および穴あけ注:このプロトコルは、NG2(ニューロン-グリア抗原2)グリアを介在ニューロンに再プログラミングするためのAscl1、Lmx1a、およびNurr1(ALN)の使用に焦点を当てています。私たちの経験では、同様の表現型の介在ニューロンは、他の因子の組み合わせを使用して取得できます
   定位
   1. 固定フレームのM / L-D / Vアームを所定の位置(動物の上)に移動し、固定します。
      注:定位固定フレームを使用すると、前方/後方(A / P、Y軸)、内側/外側(M / L、X軸)に沿ってシリンジを調整できます。 および背側/腹側(D / V、Z軸)軸。
   定位
   2. 固定フレームの異なる軸に沿って注射器を動かして、ガラス毛細血管の先端をブレグマ(異なる頭蓋プレートが交わる接合点)のすぐ上に近づけます。
   3. 毛細管の先端が A/P 面と M/L 面の両方で完全に真っ直ぐであることを確認してください。あいまいな前骨の場合は、外側縫合糸と正中線縫合糸の平均を取ります。
   4. 毛細管の先端がブレグマの上に正しく配置されたら、デジタル座標カウンタのM/L値とA/P値の両方を0.0にリセットします。
   5. 動物の頭が完全に平らな位置にあることを確認するには、デジタル座標カウンタを使用して、A/Pアームが+2.0および-2.0(M / L = 0.0)のとき、およびM / Lアームが+2.0および-2.0(A / P = 0.0)のときにD / V座標値を測定します。それに応じて歯のバーとイヤーバーの高さを調整します。
   線
   6. 条体にウイルスベクターを注入するための目的の座標にシリンジを移動します(A / P = + 1.0;M / L = -2.0、ブレグマに対して)。
   7. 注射器を少し上げ、顕微鏡で注射部位を見て、注射座標に歯科用ドリルを使用して穴を開けます。円形で穏やかな方法で作業しながら、現場で穴あけを開始します。
      注:ドリルビットは追加の力を加えずに骨を貫通するのに十分な鋭さである必要があるため、下向きの圧力をかけすぎないでください。長時間の持続的な穴あけは熱を発生するため避けてください。
   8. 穴あけの最後に、硬膜が無傷のままで、注射のために露出していることを確認します。
2. シリンジのセットアップの準備
   1. 開いた切開部に綿ガーゼを置き、生理食塩水でシリンジを洗い流します。
   2. フラッシング後、1〜2 μLの気泡を取り込み、続いてウイルスベクターを含む溶液1 μLを取り込み、意図しない気泡を避けます。注射中に、ウイルス溶液が気泡の下に簡単に見えるようにしてください。
3. ウイルス注射
   切
   1. 開部位から綿ガーゼを取り外し、定位固定フレームの D/V アームを使用して注射器を下げます。頭蓋骨の表面に近づいたら、顕微鏡を注意深く見て、硬膜の D/V レベルを測定します - 穏やかな圧力でわずかに膨らむはずです。
   毛
   2. 細管の先端で硬膜に触れながら、D/V座標を0.0に設定します。
   3. シリンジを下げ、希望の深さ(硬膜に対してD / V = -2.7)までゆっくりと進みます。針/毛細血管の曲がりが観察されないように、軌道に骨片がないことを確認してください。
      注:提示された座標は、NG2-Creマウスの線条体へのリプログラミング因子の注入を指します。他の脳領域に対応する座標を使用できます。新しいマウス系統の脳にリプログラミング因子を注入する前に、必ず最初に色素(トリパンブルーなど)、カラービーズ注射、またはレポーターウイルスベクターを使用して注射の座標をテストしてください。トリパンブルーを注射する場合、手術直後に動物を犠牲にし、脳を解剖する必要があります。新鮮な脳は、冷凍した状態でミクロトームを使用して切断でき、脳内の色素位置を視覚化することによって注射部位を決定します。色付きのビーズを使用して座標をテストすると、注入から1週間後に灌流および切断された脳の注入部位を決定することが可能です。あるいは、レポーター遺伝子を保有するウイルスベクターによる注射を使用し、灌流切断された脳で注射部位を決定することもできます。
   4. 1 μLのウイルス溶液を0.4 μL/分の速度で注入します。全容量を注入したら、シリンジを抜く前に2分間の拡散期間を待ちます。
   5. 拡散後、毛細血管の先端が脳から完全に出るまで、注射器をゆっくりと引っ込めます。
   6. 綿ガーゼを傷口の上に置き、注射器を生理食塩水で洗い流します。
   7. 定位固定フレームのM/L-D/Vアームを作業領域の外に移動します。
4. 創傷閉鎖と術後の手順
   1. 縫合糸を使用して切開部を慎重に縫合します。
      注:注射された動物に使用されるすべての縫合糸は、抗ウイルス洗剤溶液を含むカップ/バイアルに廃棄する必要があります。同じ溶液を使用して、手術材料と接触した手術領域の周囲のすべての表面を洗浄します。すべての手術器具は、各手術日の終わりに徹底的に洗浄され、オートクレーブ滅菌されます。
   2. 動物を定位固定装置から取り出し、清潔で加熱されたケージ、食物と水へのアクセス、および動物が完全に目覚めるまで留まる術後ステーションに置きます。この期間中、意識が回復するまで動物を注意深く監視してください。
   3. 前者が手術から完全に回復するまで、手術を受けた動物を手術されていない動物と一緒に収容しないでください。
   4. 毎日、操作された動物を監督します。使用する縫合糸に応じて、必要に応じて必ず抜いてください。すべての動物は、術後ケアとしてブペノルフィナム(1ml / kgのTemgesic)を皮下投与されました。
      注:同じ注射器を使用して2日間連続して操作する場合は、水で洗い流し、続いてエタノール70%と再び水で洗い流します。シリンジを水で満たしたままにして、残留物を溶解させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物モデル
NG2-Creマウス	Jackson	NG2-CrexB6129、在庫#008533
試薬
水
生理食塩水	Apoteket AB		70%
エタノール	ソルベコ
イソルフラン	Apoteket AB		温水で 1% 溶液に希釈
Virkon	Viroderm	7511
ペントバルビタール	Apoteket AB	P0500000	RSGの60 mg/ml
クロース	Merck	S0389-500G
Trypan Blu	Thermo Fisher Scientific	15250061
トロビーズ	Lumafluor	R170
Buprenorphine	Apoteket AB
機器			ゾーリンゲン
さみ	VWR	233-1552	生化学
セット	VWR	232-0007
鉗子	VWR	232-0120
メスホルダー	VWR	RSGA106.621	番号 20
メス	VWR	RSGA106.200
定位固定フレーム	Stoelting Europe	51500D
マウスイヤーバー	Stoelting Europe	51648	5 ul
シリンジ、取り外し可能な針付き	Hamilton Company 65		0.75 内径と 1.5 外径。
ガラスキャピラリー	Stoelting	50811
ガラスキャピラリープーラー	Sutter company	P-1000
歯科用ドリル	Agnthos AB	1464
シェーバー	Agnthos AB	GT420
イソフルランチャンバーとポンプ	Agnthos AB	8323101	2 mL
シリンジ	メルク	Z118400-30EA	25G
ニードル	メルク	Z192414 アルドリッチ
および新生児ラット 定位固定フレーム用アダプター	ストールティング	51625
加熱パッド	Braintree scientific, inc	53800M
コットンガーゼ	フィッシャーサイエンティフィック	22-037-902
ゴムチューブ	Elfa Distrelec	HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150
綿棒フィ	ッシャーサイエンティフィック	18-366-473

スレの用量での最終処置用はピン マウス