麻酔マウスのてんかん病巣へのGABAの電気泳動送達

要約

出典: Slezia, A. et al.てんかん病巣へのγ-アミノ酪酸(GABA)の電気泳動送達はマウスの発作を予防するJ. Vis. 経験。(2019年)

このビデオは、麻酔マウスの発作活性を阻害するためのガンマアミノ酪酸(GABA)の電気泳動送達を示しています。プローブの埋め込み、神経活動の記録、発作の誘導、およびマイクロ流体イオンポンプを介した制御されたGABA送達に関わる手順を概説し、その治療効果を評価します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.手術/開頭術

1. 麻酔をかけたマウスの頭を定位固定フレームに固定します。30 Gの針を使用して、局所鎮痛薬ロピバカイン(5 μL、7.5 mg / mL、 材料表を参照)を計画された切開部位に皮下注射します。有効になるまで5分待ちます。
メ
2. スで頭蓋骨の上の皮膚にまっすぐな正中線を作ります。細い鉗子で皮膚を横にそっと引っ張り、ブルドッグのセレファインクランプで脇にクランプして、頭蓋骨を露出させてさらに作業します。
3. メスまたは同様の道具で筋膜の頭蓋骨をきれいにします。表在性出血の場合は、綿棒またはペーパータオルの小片で血液を取り除きます。
4. ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)ポリスチレンスルホン酸塩(PEDOT:PSS)でコーティングされたアースネジ(サイズ:#00、直径:0.047インチ、長さ:1/8インチ、 材料表を参照)をはんだ付け線で取り、コネクタでアンプヘッドステージに接続します。
5. 目的の穴の部位で頭蓋骨を湿らせ、硬膜が見えるまで小脳の上の頭蓋骨に細い丸いドリルビット(直径0.4 mm)を使用して高速で穴を開けます。アースネジを穴に入れ、小脳の上部に達するまで精密ドライバーでねじ込みます。
   注:ヘッドスクリューを重量比1%3-グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシラン(GOPS)を含むPEDOT:PSS溶液で浸漬し、続いて140°Cで90分間ベーキングしました。PEDOT:PSSは、生体適合性があることが知られている体積静電容量を持つ共役ポリマーです。GOPSは、水性媒体での安定性を高めるためにPEDOT:PSSと混合された架橋剤です(図1)。
6. 定位固定フレームの助けを借りて、目的の脳領域の定位座標を測定します。たとえば、関心のある領域は、マウスの脳アトラスに基づくブレグマ点から1.8 mmの海馬、前後(AP)-1.8 mmおよび中外側(ML)です。
   注:これらは右半球の座標です(図1)。
7. 薄く、よく磨かれた透明な骨膜が残るまで、信頼性の高い歯科用ドリル( 材料表を参照)を使用して、ターゲット領域の上の頭蓋骨の直径約1〜2 mmの領域を薄くします。
8. 次に、骨膜の厚さが十分に薄い(<200μm)場合は、薄い鉗子で小さな穴を開け、骨の薄い層をそっと取り除きます。特注のフック付き針を使用して硬膜を取り除きます。浮腫の発症を防ぎ、脳の心臓および/または呼吸の脈動を最小限に抑えるために、開頭術と硬膜切開のサイズを最小限に抑えます。
   注:開頭術は、乾燥を防ぐために生理食塩水の液滴で満たし、実験中に定期的に補充する必要があります(図1)。

2. マルチチャンネルシリコンプローブの挿入

1. シリコンプローブにわずかなAP角度(20°)で定位固定アームを使用して、他の2つのインプラントの位置決めに十分なスペースを確保し、電極、イオンポンプ、マイクロピペットの記録部位と注入部位をできるだけ近づけます。
   注:電極、シリンジ、およびイオンポンプを一滴のDiI染色溶液(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸[DiI])で覆い、移植トレース(ジメチルスルホキシド中の0.5 mg / ml DiI)を事後視覚化しました。
2. シリコンプローブを磁気ホルダーに取り付けた定位アームに置き、定位固定フレームの横に置きます。AP角度(20°)を設定し、プローブをヘッドステージとアースネジに接続します。
3. 横方向の動きを避けるために、ミクロン精度の定位固定装置アームまたは電動マイクロマニピュレーターを使用して、シリコンプローブを海馬にゆっくりと下げます(図1および図2)。
   1. 記録ソフトウェアを開始し、ヘッドステージ、接続されたアンプ、およびコンピューターを使用して、マルチチャネルシリコンプローブを皮質の上部から、目的の背腹側(DV)位置(皮質表面から-1,800μm)に達するまで動かしながら、電気ニューロン信号を記録します。浸透中の局所電界電位信号(LFP)をコンピューター画面に記録して監視します。
      注:プローブの降下を制御して、記録中にプローブがゆっくりと連続的に移動するようにし、浸透とターゲットゾーンへの到達をより視覚的に制御します。
   2. 記録されたLFPの海馬形成層のピラミッド層のリップル活動を、ターゲットゾーンのマーカーとして使用します。
      注:リップル活動は、記録部位間の距離が100μmのマルチチャネルシリコン(Si)プローブの1つまたは2つの隣接するチャネルで見られます(図3)。
   3. マルチチャネルSiプローブを使用して、マルチチャネルアンプのソフトウェア( 材料表を参照)を介して、皮質と海馬の層からのLFP信号を同時に記録します(図3)。

3.マイクロ流体イオンポンプ(μFIP)の挿入チューブ

1. ( 材料表を参照)をμFIPの入口に接続し、プローブに0.05 Mガンマアミノ酪酸(GABA)溶液を充填します。チューブを取り外し、パラフィンフィルムでインレットを閉じます。電気リード線をソース測定ユニットに接続します。
定位
2. 固定装置アームを使用して、μFIPを内外側(MP)角度(20°)で挿入します。Siプローブは、プロセス全体を通して挿入されたままです。
   注:μFIPは非常に柔軟であり、小さくてきれいな絵筆のサポートで、脳表面に到達するまでまっすぐに保つことができます。そのステップの後、μFIPは軸方向の動きで緩やかに下げることができます。
3. 軸方向の動きでμFIPをゆっくりと下げ、背腹側(DV)座標(皮質表面から-1,200μm)に達するまで、軌道中に曲げないようにしてください。
   注:μFIPチップからの出口の距離が300μmであることを考慮して、2つのデバイス(μFIPとシリコンプローブ)をできるだけ近づけるようにしてください。
   注意:挿入中にデバイスとそのコネクタ間の機械的な問題を回避します(図1Bおよび図2B)。

4.発作誘発装置の準備

注射

1. 器の金属針(10 μL)を交換します( 材料表を参照)。針保持金属部分を取り外し、マイクロピペット(外径[OD]:1.2 mm、内径[ID]:0.75 mm、チップ直径:20〜50 μm、シャンクの±0.5 cmのテーパー)を配置して固定し、針保持要素を交換します。
2. シリンジと付属のホウケイ酸マイクロピペットを20°の横内側(LM)角度で配置して、4-アミノピリジン(4AP)(人工脳脊髄液[ACSF]中で50 mM)を注射します。
   注意:シリンジの金属針や先端が50μmを超えるマイクロピペットは使用しないでください。
3. 自動マイクロインジェクションポンプを使用して、500 nL〜1 μLの50 mM 4APを抽出します。

5. 4AP注入用のシリンジに取り付けられたガラスピペットの挿入

シ

1. リンジに取り付けられたガラスマイクロピペットを目的のDV位置(-1,500 μm)まで下げ、250 nLの4AP溶液を注入します(図1および図2)。録音ソフトで録音を開始します。画面を見て、最初の発作間期スパイクが表示されるのを待ちます。
2. 最初の発作間期スパイクの出現とともに、すぐにμFIPによるGABA送達を開始します。ソースとターゲットの間に1Vを100秒間印加し、その後1秒間30サイクルオフしてGABAを送達します。記録ソフトウェアを使用して、最低2時間記録します。
   注:送達されたGABAの総質量は約1 nmolです(図4)。
3. 実験の最後に、挿入されたプローブとアースネジをそっと取り外し、動物を定位固定装置から取り外します。動物は、薬物の過剰摂取(i.p.100mg / kgペントバルビタール)を使用して安楽死させました。死亡は呼気と循環の停止によって確認された。

結果

図1:マウス脳における頭蓋硬膜切開術とインプラントの局在化。 (A)マウス脳における手術、開頭術、およびインプラントの標的の概略図。(B) 3 つのデバイスの移植に定位座標と角度を使用しました。μFIP = 20°中外側(ML)、-1,200μm DV(緑)。マルチチャンネルシリコンプローブ = 20° AP、-1,800 μm DV (青)。シリンジ付きマイクロピペット = 20° LM、-1,500 μm DV...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4AP	Sigma	275875
Amplifier	Neuralynx、モンタナ州、米国	Lynx 4SX
アンプ	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	アレン アトラス	978-0470054086
ボロシリカ ガラス ピペット	サッター	BF120-69-15
ブレイン マトリックス	WPI	RBMA-200C
骨トリマー	FST	16109-14
コネクタ	INSTECH	SC20/15
コトン タイジ	モノプリ	EMD 6107OD
カバースリップ	メンゼルガラス	15747592
DiI ステイン	サーモフィッシャー	D282
DMSO	シグマ	11412-11
ドリル	FOREDOM	K1070
鉗子	FST	11412-11
GABA	シグマ	A2129
GOPS	シグマ	440167-100M
ハミルトン シリンジ	ハミルトン	80330
ヘッドスクリュー	コンポーネント サプライ	TX00-2FH
加熱パッド	ハーバード装置	341446
インジェクション ポンプ	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
ケタミン	Renaudin	5787419
磁気ホルダー	Narishige	GJ-1
マウス	チャールズ リバー	612
モーター マニピュレーター	Scientifica、英国	IVM
水素二ナトリウムリン酸塩	シグマ	255793
酸二水素ナトリウム	グマ	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
ペーパータオル	キンバリー・クラーク	7552000
PB	シグマ	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS		81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
直腸温度プローブ	ハーバード大学装置	521591
ロピバカイン	KABI	1260216
生理食塩水	グマ	7982
メス	F.S.T	AUST
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine クランプ	FST	18050-28	4 をお勧めします
シリコンプローブ	NeuroNexus、ミシガン州、米国	A2x16-10mm-50-500-177 または A1x16-5mm-150-703
立体毒性フレーム	Stoelting	51733U
キシラジン	バイエル	4007221032311

Digital リンシシ R195806