マウス脳における標的ニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射

要約

出典: Fricano-Kugler, CJ, et al.定位注射による高力価CRISPR Retroおよびレンチウイルスの設計,パッケージングおよび送達J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、マウス脳における正確なニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射を示しています。このプロトコルは、歯状回への正確なウイルス送達を保証し、蛍光標識とCRISPRを介した遺伝子ノックアウトを可能にして、in vivoでの神経回路、遺伝子機能、および疾患メカニズムを研究します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 定位固定注射

1. 適切な空気の流れを確保するために、手術室への換気が開いていることを確認します。誘導チャンバー内で4%イソフルランでマウスを麻酔することにより、マウスを手術の準備をします。麻酔後、頭を剃って注射部位を準備します。
   ピン
   1. セットを使用して舌を下と横に動かし、マウスを定位固定装置に置きます。歯がスロットに落ちるまでバイトバーを口に挿入し、イヤーバーを固定します。マウスの本体が加熱パッドの上にあり、ノーズがノーズコーンにあることを確認してください。4%イソフルランをノーズコーンに直接注入します。ピンセットで足をつまみ、驚愕反射がないことを確認して麻酔を確認します。
   2. 人工涙液を塗って目を滑らかにします。ポビドンヨードとリドカインを交互に回して坊主頭を拭いて、注射部位の準備を終了します。
2. メスを使用して、頭皮の中心に沿って小さな切開を切ります。必要に応じて綿棒と過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させ、ブレグマを視覚化します。
   1. 解剖スコープを使用して、頭蓋骨のブレグマを見つけ、ドリルの先端をブレグマの上に置きます。x、y、z平面上のデジタル定位座標をゼロ(または記録)します。
   2. ヘッドが吻側から尾側の y 軸で水平になるようにするには、ドリル ビットをラムダに置き、z 座標がブレグマとラムダの両方でほぼ等しくなるようにヘッドを水平
   にします。
   3. ヘッドがx軸上で水平になるように、ドリルビットをy = 1/2ラムダに配置します。Z座標が矢状縫合糸の両側で1 mm(x = +/-1 mm)に等しいことを確認してください。ラムダの左右に1mmのz座標に差がある場合は、頭蓋骨を調整します。
3. ドリルを目的の座標の上に置きます。歯状回には、ブレグマの座標y = -1.9とx = +/- 1.1を使用します。穴あけする前に、イソフルランを2%に下げてから、ゆっくりと慎重に頭蓋骨に穴を開けます。
   1. すべての穴を開けた後、充填された注射器を定位固定装置に取り付けます。シリンジを穴の中央に視覚的に配置し、頭蓋骨のz座標をゼロ
   にします。
   2. シリンジを最も深いz深さまでゆっくりと下げます。歯状回の場合、z の深さは -2.5、-2.4、および -2.3 です。定位固定インジェクターを使用して、0.25 μl/min の速度で注入を開始します。
      1. 最も低いZ深さで注入が完了したら、1分間待ってから、次の座標まで上げて、注入を再開します。すべてのZ注入座標が注入されるまで、このパターンを続けます。最後の注射後にシリンジを取り出す前に2分間待ちます。
         注:マウスの脳に半球あたり最大2μlのウイルスを注射することにより、組織への悪影響は認められていません。
   3. 他のボーリング孔に対して注入を繰り返します。
4. 注射後、定位固定装置からマウスを取り外し、6-0シルク縫合糸で頭皮を縫合します。リドカインと抗菌クリームを傷口に塗ります。
   1. 0.8-1.0 ml 生理食塩水 + ケトプロフェン (3-5 mg/kg) を腹腔内 (IP) 経路で注射して、痛みを管理します。次に、マウスを加熱された回収チャンバーに入れます。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。完全に回復するまで、動物を他の動物と一緒に戻さないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
定位固定手術試薬
獣医注射器獣医用 T.B. シリンジのみ 1cc ルアースリップ T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
イソフルラン
ステンレススチールメスの刃、#10、100 個入り	Med-Vet International	JOR580S
人工涙液軟膏	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
生理食塩水	Med-Vet International	DYND500MLSH
コットンチップアプリケーター	Med-Vet International	CTA6
トリプル抗生物質軟膏	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® 針ソフトパック 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 シルク縫合糸	Med-Vet International	MV-711