ニワトリ胚における神経および血管ネットワークの可視化

要約

出典: Delalande, J., et.al.ニワトリ^GFP神経管移植とカルボシアニン色素DiI注射を用いたニワトリはい内の神経堤細胞と血管の二重標識J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオは、GFP標識ドナー神経管を、ステージマッチングトランスジェニックニワトリ胚から体節1〜7のレベルでレシピエント胚に移植し、続いて親油性蛍光色素を使用した血管標識を示します。組み合わせたアプローチにより、立体蛍光顕微鏡下で胚を直接視覚化できるため、卵巣における神経移植片の統合と血管ネットワークの発達の研究が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 組織を移植

する

1. ガラス製マイクロピペットを使用して、解剖した神経管を時計ガラスから宿主胚に慎重に移します。神経管を正しい前後方向に配置し、マイクロメスを使用してニワトリ宿主の切除領域に隣接する外植片をそっと押します。神経管の向きを特定するために、外胚葉の小さな断片を背側表面に付着させるか、小さな切り込みを入れて残します。
   1. 必要に応じて、マイクロメスを使用して、切除領域の正確なサイズに外植片をトリミングします。
2. 神経管を切除領域にそっと導き、背側が正しい方向になるように配置します。マウスチューブに取り付けられたガラス製マイクロピペットを使用して、移植片の周囲のPBSおよび/または液体を除去します。これにより、ドナー組織と宿主組織が接着し、移植片が定着します。
3. 脱水や汚染を防ぐために、窓全体を幅24mmの透明テープで密閉します。
4. 卵の殻に鉛筆で印を付けてキメラ胚にラベルを付け、その番号を実験簿に記録します。卵をインキュベーターに戻してさらに発育します。

2.宿主胚の血管にDiIを注入

する目的

1. の実験時点(ここでは3〜10日後)に、インキュベーターからキメラ胚を取り出し、まっすぐなハサミを使用して透明なテープを剥がして、卵子内の胚にアクセスします。
2. 必要に応じて、はさみを使用してシェルのウィンドウを拡大します。絨毛尿膜が殻に付着している場合、出血を引き起こし、血管の標識を危険にさらす可能性があるため、脈絡尿膜を損傷しないように注意してください。
3. 卵黄のアクセス可能な静脈を選択し、血流が胚に向けられるようにします。卵黄静脈の1つの分岐点を選択します(図1B、C)。
   注:E6.5〜E7.5では、卵黄静脈にアクセスするために、絨毛尿膜をピンセットでそっと脇に移動する必要がある場合があります。E8.5の後、この段階までに絨毛尿膜が胚を完全に覆うため、唯一の選択肢は絨毛尿素膜静脈の1つに注射することです。
4. 選択した注入点の上の卵黄膜を、2本のDumont#5ピンセットを使用して反対方向に引き裂いて取り除きます。
5. Dumont #5を使用して引っ張られたガラス針を折り、その直径を静脈のおおよそのサイズに調整してから、CellTracker CM-DiIでロードします。DMSO中で40 μg/μlのDiIストック溶液を作り、-20°Cで保存します。作業溶液を4 μg/μlの濃度で0.3 Mスクロース/ PBSで調製します。
   1. マウスチューブによる吸引を使用して、0.3 Mスクロース/ PBS中の5〜10 μlのDiIを針に吸引します。古い胚には、最大25μl以上が必要になる場合があります。E8.5以降、胚にはより大きく、より筋肉質な静脈があり、DiIを装填したガラス針で刺す前に、デュモン#5で所定の位置に保持する必要がある場合があります。
6. 針を静脈に素早く挿入し、口管で着実に息を吹きかけると、DiIが血栓を形成せずにゆっくりと血流に加わります。または、DiIデリバリーに圧力インジェクターを使用します。

結果

図 1.静脈内DiI注射。(A) 推奨器具: a) CellTracker CM-DiI パラフィルムへのドロップ、b) プルガラス注射針、c) マウスチューブ。(B)E4キメラニワトリ胚への静脈内DiI注射の概略図。(C) 卵 DiI 静脈内注射で、静脈に挿入された DiI を含む細いガラス針を示します (矢印)。(D)GFP +神経管(矢印)によるDiI注射後のE4キ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
精したひよこ卵	Henry Stewart and Co、ラウス、英国
受精したGFPのひよこ卵	ジンバラ
インキュベーター (Profi-H Hatcher)	Lyon Technologies, CA, USA	910-033
14C インキュベーター	精密冷却インキュベーター、Leec Ltd.、ノッティンガム、英国	モデル LT2
実体顕微鏡	LEICA	モデル MZ 12.5
デジタルカメラ	LEICA	DC500
画像取得ソフトウェア	LEICA	IM50
グースネックハロゲン冷光源	Advanced Imaging Concepts, Inc	KL 1500 LCD マウス
チューブ	SIGMA - ALDRICH	A5177
トランスファーピペット、ポリエチレン	SIGMA - ALDRICH	Z350796
Dumont #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11251-30
ミニチューンピン	ファインサイエンスツール	26002-15
Dumont AA鉗子、Inoxエポキシコーティングファ	インサイエンスツール	11210-10
ロテープ(クリア、幅24mm)	任意のサプライヤーCellTracker
CM-DiI	分子プローブ	C-7001
ロシリケートガラス毛細管、フィラメントなしの薄壁	バード装置	PY8 30-0035

受 エ大学ロスリン研究所のトランスジェニックチキン施設 卵セホハー