ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

サマリー

Ti:Sapphireフェムト秒レーザー発振器からの2光子吸収を使用して、ケージされた蛍光タンパク質を含む単一細胞を光活性化する方法が説明されています。光活性化細胞の運命マッピングには、免疫組織化学が使用されます。 この手法は、どの細胞タイプにも適用できます。

要約

単一細胞を鑑別的に標識する能力は、発生生物学において重要な意味を持っています。例えば、造血系、リンパ系、血管系譜が発生中の胚でどのように発生するかを決定するには、未分化前駆細胞の運命マッピングと系統追跡が必要です。近年、Eos^{1, 2}, PAmCherry³, Kaede^4-7, pKindling⁸, KikGR^{9, 10}などの光活性化性タンパク質が、細胞トレーシングプローブとして広く注目されています。これらの感光性タンパク質の蛍光スペクトルは、UV励起で容易に変換できるため、細胞の集団を隣接する細胞と区別することができます。しかし、活性化タンパク質の光効率は、長期的な細胞追跡を制限する可能性がある¹¹。光活性化可能なタンパク質の代替として、ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランは、胚モデルシステム^7、12-14で広く使用されています。従来、フルオレセイン−デキストランをアンケージするためには、蛍光ランプハウスからのUV励起または単一光子UVレーザーが使用されてきた。しかし、そのような光源は、光活性化の空間分解能を制限する。ここでは、運命マップ、系統追跡、および単一標識細胞の検出のためのプロトコルを報告します。ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランを注入した胚の単一細胞は、チタンサファイアフェムト秒レーザーから生成された近赤外レーザーパルスで光活性化されます。このレーザーは、この論文で使用したLSM 510 META NLO顕微鏡など、すべての2光子共焦点顕微鏡で一般的に使用されています。生体組織は近赤外線照射に対して透明であるため¹⁵、レーザーパルスは、選択された焦点面の上または下の細胞をアンケージすることなく、胚の深部に焦点を合わせることができる。したがって、非線形の2光子吸収は、単一細胞内のフルオレセイン-デキストランをアンケージするための幾何学的焦点でのみ誘導されます。ケージに入れられていないフルオレセイン-デキストランを含む細胞を検出するために、活性化細胞を迅速に視覚化するための簡単な免疫組織化学プロトコル¹⁶について説明します。このホワイトペーパーで紹介する活性化および検出プロトコルは汎用性が高く、どのモデルシステムにも適用できます。

注:このプロトコルで使用される試薬は、記事の最後に追加された表に記載されています。

プロトコル

1. ケージドフルオレセイン-デキストランの合成(文献14より適応)

1. ddH₂Oで希釈したホウ酸ナトリウムの0.1 M溶液を調製します。
2. 10 kDaのアミノデキストラン4 mgを測定し、CMNBケージフルオレセインチューブに加えます。.
3. 調製したホウ酸ナトリウム溶液500μL(ステップ1.1)をCMNBケージフルオレセインチューブに加えます。チューブとボルテックスに30秒間キャップをして、混合物を溶解します。
4. 混合物を室温のニューテーターで一晩反応させます。チューブを金属ホイルで覆い、混合物が周囲光にさらされるのを防ぎます。
5. Zeba脱塩スピンカラムを入手し、ボトムキャップをひねって外します。カラムにドットをマークします。これは、遠心分離時にカラムの向きを示すために使用されます。カラムを 15 mL の円錐形 Falcon チューブに入れます。注:スピンカラムの溶液はカラムバッファです。
6. 脱塩スピンカラムのトップキャップを緩めます。脱塩スピンカラムを収納する15 mLの円錐形Falconチューブを遠心分離機に入れます。マークされたドット(ステップ1.4)が遠心分離機ローターの中心を向くようにスピンカラムを向けます。 チューブを1000 x gで室温で2分間遠心分離します。
7. 遠心分離後、脱塩スピンカラムをFalconチューブから取り出します。 収集したフロースルーと15mLコニカルチューブの両方を廃棄します。新しい15 mLコニカルFalconチューブを入手し、脱塩スピンカラムを新しいFalconチューブに入れます。注:遠心分離後、カラムレジンベッドは圧縮されたように見えます。列はすぐに使用してください。
8. ステップ1.3で反応した混合物(ケージに入れられたフルオレセイン-デキストラン)を取得します。スピンカラムからキャップを取り外し、反応した混合物を吸引し、脱塩スピンカラムの中心にゆっくりと塗布します。反応した混合物を塗布した後、スピンカラムのキャップを交換します。
9. 脱塩スピンカラムを収容するファルコンチューブを遠心分離機に入れます。 ステップ1.5で行ったように、マークされたドットが遠心分離機ローターの中心を向くようにスピンカラムを向けます。チューブを1000 x gで室温で2分間遠心分離します。
10. 遠心分離後、黄色の混合物(ケージに入れられたフルオレセイン-デキストラン)を15mLのFalconチューブに回収します(約400μL)。ケージに入れたフルオレセイン-デキストラン混合物を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
11. 混合物が周囲光にさらされるのを防ぐために、すぐにチューブを金属ホイルで覆ってください。ケージに入れたフルオレセイン-デキストラン混合物をspeedvacで凍結乾燥します。350 μLの凍結乾燥には約4時間かかります。
12. 完全な凍結乾燥後、粉末(約3 mg)をddH₂Oの最終濃度約1%w / vに再懸濁します。
13. ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランを別々の金属箔で覆われたチューブに分注し、それらを -20°C。

2. ケージドフルオレセイン-デキストランの胚採取とマイクロインジェクション

* この手順では、ゼブラフィッシュを動物モデルシステムとして使用します。

1. 注射の前日に、ゼブラフィッシュを仕切り付きの繁殖水槽でオスからメスに1:1またはオスからメスに2:1で交差させるようにセットアップします。
2. 翌朝、飼育水槽の水を交換し、仕切りを取り外します。ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランの5 μL 1/10希釈した作業溶液を、1 X Danieau培地(溶液の調製を参照)またはddH₂Oのいずれかで直ちに調製します。作業溶液チューブを金属ホイルで覆い、光への曝露を防ぎます。
3. 調製したケージに入れたフルオレセイン-デキストラン溶液(ステップ2.2)を針にピペットで入れます。解剖顕微鏡で針先を適切なサイズに切断する前に、白色光源の前に透明な黄色のフィルターを置きます。黄色のフィルターは、注射中のフルオレセイン-デキストランの自発的なケージ解除を防ぎます。眼球接眼レンズを通して見ると、光源は黄色に見えるはずです。
4. 胚を採取し、マイクロインジェクションモールドトレイにピペットで移します。マイクロインジェクション時間を、ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランを3〜4 nL送達するように設定します。解剖顕微鏡下で、鉗子で胚を向き直し、ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランを割球細胞の基部(割球-卵黄界面)に注入します。注射のための胚期は1〜2細胞期でなければなりません。
5. 注入後、マイクロインジェクションモールドトレイから胚を取り出し、新鮮な魚水が入った清潔なシャーレに入れます。 メチレンブルーを魚水に添加して、最終濃度0.02%w / vで真菌の増殖を防ぐことができます。注入されたケージに入れられたフルオレセイン-デキストランのケージ解除を防ぐために、ペトリ皿を金属ホイルで覆います。.
6. 注入した胚を、目的の細胞を光活性化する必要がある段階まで上げます。光活性化のために、_ddH2O中に0.6%低融点アガロース溶液を調製し、胚の段階に応じて、トリカイン(MS222)を低融点アガロースに添加することができる。これを行うには、0.02%トリカインを低融点アガロースで最終濃度0.0014%に希釈します。
7. 胚が適切な発生段階に達したらすぐに、鉗子を使用して1 X Danieau培地で胚をデコレーションします。デコレーションするときは、透明な黄色のフィルターが白色光源の経路に配置されていることを確認してください(手順2.3を参照)。
8. 0.6 % 低融点アガロース溶液を 37 °C に加熱し、低融点アガロース1 mLをLabTekチャンバーカバーガラススライドのウェルにピペットで移します。3〜4個の胚を低融点アガロースに慎重にマウントし、光活性化する細胞が底部カバースリップに対して下を向くように鉗子で向きを変えます。
9. アガロースが固まるのを待ちます。固化後、1 X Danieau培地1 mLをアガロース上にピペットで移します。
10. 手順2.8から2.9を繰り返して、より多くの胚を作成します。

3. ケージ入りフルオレセイン-デキストランの二光子活性化

* この手順は、胚がレポーターGFPを発現していることを前提としています。 胚は、LSM 510 META NLO顕微鏡に取り付けられたアルゴンイオン(488 nm)レーザー光源を使用して観察されます。単一のGFP陽性細胞を選択し、LSM 510に結合したMai Taiレーザー(フェムト秒レーザー)を使用して光活性化します。この手順は、非蛍光胚でも同じです。あるいは、白色光を使用して活性化する細胞を見つけ、続いてMai Taiレーザー光源を使用して活性化することもできます。

1. LSM 510 ソフトウェアをロードします。白色光線路に透明な黄色のフィルターを配置します。
2. [新しい画像をスキャン]を選択し、[エキスパートモードの開始]をクリックします。
3. [レーザー] タブを選択し、アルゴン イオン (488 nm) とマイ タイ (フェムト秒) レーザー光源をオンにします。
4. マイタイの波長を740nmに設定します。
5. 「config」タブを選択し、アルゴンイオンとMai Taiレーザーの光路構成を設定します。
6. [スキャン]タブを選択し、目標を20X/0.8に変更します。
7. [最大] をクリックして、最大スキャン速度を設定します。
8. [モード]、[方法]、および [数値] を [行]、[平均]、および [1] に設定します。
9. [チャンネル]タブで、Mai Taiを除くすべてのレーザー光源の選択を解除します。
10. 光ビームパスにパワーメーターを配置します。
11. [Cont]ボタンを選択して、連続スキャンをアクティブにします。
12. パワーメーターが平均レーザー出力47mWを読み取るまで、透過率を調整します。
13. [停止] ボタンを選択してスキャンを停止します。
14. [チャンネル] タブで [Mai Tai] レーザー光源の選択を解除し、アルゴン イオン (488 nm) を選択します。
15. [Fast xy] ボタンを選択します。[チャンネル]タブで、アルゴンイオンレーザーのピンホール、検出器ゲイン、増幅器オフセット、および増幅器ゲインを調整して、最高の画質を実現します。
16. ステージコントローラーを使用して、活性化するセルを見つけて焦点を合わせます。
17. 「停止」ボタンをクリックします。
18. ズームツールを使用して、[モード]タブのズーム倍率が50〜70になるまで、アクティブ化されたセルをズームインします。
19. [停止] ボタンを選択してスキャンを停止します。
20. [チャンネル]タブで、アルゴンイオンレーザー(488 nm)の選択を解除し、Mai Taiレーザーを選択します。
21. [モード]タブで、スキャン速度を31.46秒に設定します。
22. [シングル]ボタンを選択して、選択した細胞のケージドフルオレセイン-デキストランの2光子活性化のスキャンを開始します。
23. アクティベーション後、[チャンネル]タブでMai Taiレーザーの選択を解除し、アルゴンイオンレーザー(488 nm)を再度選択します。
24. [モード]の下のズーム倍率を1に設定し、[速度]見出しの下の[最大]ボタンをクリックして、最速のスキャン速度を設定します。
25. Fast xy を選択して、光活性化領域を確認します。光活性化領域がレーザーアブレーションされていないことを確認してください。レーザーアブレーションの詳細については、ディスカッションセクションを参照してください。
26. 他の胚についても上記の手順を繰り返します。

4. ケージに入れられていないフルオレセイン-デキストランの免疫検出(文献16より適応)

1. 光化後、白色光源の前に透明な黄色のフィルターを置き、鋭利な鉗子を使用して低融点アガロースから各胚を手動で除去します。 除去したすべての胚を、新鮮な1 X Danieau培地を含む新しいシャーレに入れます。胚が光にさらされるのを防ぐために、ペトリ皿を金属ホイルで覆います。
2. 必要に応じて、胚を目的の発生段階まで育てます。その間に、4%パラホルムアルデヒド溶液を調製します(溶液の調製を参照)。調製したパラホルムアルデヒド1.5 mLを微量遠心チューブに分注します。
3. 胚が目的の発生段階に達した後、胚を微量遠心チューブにピペットで移します(ステップ4.2から)。光が当たらないようにチューブを金属ホイルで覆います。
4. チューブを4°Cで一晩中定動します。翌日、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびddH₂Oに等級付けエタノール(EtOH)溶液を調製します。30 % EtOH:PBS、50 % EtOH:PBS、70 % EtOH:ddH₂O、および 100 % EtOH。
5. 翌日、胚を4°Cから取り出し、チューブを覆っている金属ホイルを取り除き、パラホルマルデヒエ(胚を覆うのに十分な少量を残す)を迅速に吸引します。1.5 mLの30% EtOH:PBSをチューブにピペットで入れます。チューブを金属ホイルで再度覆います。チューブを室温で10分間ヌータします。
6. 50、70、および100%グレードのEtOH溶液を使用して、手順4.5を繰り返します。100%EtOH洗浄後、胚を再度100%EtOHで10分間すすぎます。
7. 洗浄後、胚を-20°Cで一晩保存します。翌日は、リン酸緩衝液Tween(PBT;溶液の調製を参照)、5 X ブロッキング緩衝液(調製のための製造元のプロトコールを参照)、マレイン酸(調製のためのプロトコールはブロッキングバッファープロトコールに記載されています)、10 mg/mL プロテイナーゼK、および10 X抗体溶液(抗フルオレセイン-AP;溶液の調製を参照)を調製します。
8. また、PBTで希釈した2%ラム血清(LS;溶液の調製を参照)を調製します。抗体を4°Cで一晩保存し、ニューテーターで振とうします。2%LSは4°Cに保つことができます。
9. 翌日、胚を-20°Cから取り出し、チューブを覆っている金属ホイルを取り除き、100%EtOHを迅速に吸引します。1.5 mLの70 % EtOH:ddH₂Oをチューブに加えます。チューブを金属ホイルで再度覆います。チューブを室温で10分間ヌータします。
10. 50 % と 30 % の等級付け EtOH 溶液、および 100 % PBT を使用して、ステップ 4.8 を繰り返します。100% PBT洗浄後、100% PBTで胚をさらに3回、10分間すすぎます。
11. 胚が24時間以上経過している場合は、プロテイナーゼKが胚を治療します。そうでない場合は、手順 4.13 に進みます。これを行うには、調製したプロテイナーゼK(ステップ4.7)をPBTで1:1000に希釈します。胚をプロテイナーゼKで10分間インキュベートします。胚が古い場合はそれ以上インキュベートします。光にさらされないように、胚を金属箔で覆ってください。
12. プロテイナーゼK処理後、胚をPBTで5回10分間洗浄します。洗浄後、ニューテーター上で胚を4%パラホルムアルデヒドに室温で30分間固定します。その後、すぐに胚をPBTで5回10分間洗浄します。光にさらされないように、胚を金属箔で覆ってください。
13. マレイン酸バッファー中の5 X ブロッキングバッファーを 1 X に希釈してブロッキングバッファーを作製し、PBT から胚を取り出し、1 X ブロッキングバッファーに入れます。胚を金属箔で覆い、室温で5〜6時間回転させます。
14. 5〜6時間のブロッキング後、胚を65°Cで15〜20分間熱ショックします。
15. 抗体溶液と前日に調製した2%LSを入手します。抗体溶液を最大rpmで遠心分離します。水相を2%LSチューブに移します。チューブを反転させて混ぜます。
16. ブロッキングバッファーからLS抗体混合物に胚を移します。 光にさらされないように、胚を金属箔で覆ってください。胚を4°Cで一晩中ヌタートします。
17. 翌日、PBTで胚を室温で6回、15分間洗浄します。 APバッファーを調製します(溶液の調製を参照)。
18. 胚を室温で2回、APバッファーで10分間洗浄します。NBT/BCIP 現像液を調製します (溶液の調製を参照)。
19. 胚をNBT/BCIPに移植します。暗闇で汚れが発達するのを待ちます。
20. 胚をPBTで3回、それぞれ5分間洗浄して発生を停止します。
21. 画像取得には、胚を0.6 %低融点アガロースまたは3 %メチルセルロースにマウントし、倒立または直立した複合顕微鏡を使用して画像を取得します。
22. 光活性化されたサンプルは、グレーディングされたEtOH洗浄液で脱水することにより、将来の分析のために保存できます(染色は安定したままです)。手順4.4から4.7に従って、サンプルを脱水します。

5. 代表的な結果:

Figure 1.ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランの光活性化。(A,B)光活性化前の13/14体節期におけるゼブラフィッシュの胚の側面図の明視野および蛍光画像。(C,D)胚は、波長740 nm、スキャン時間31秒、平均レーザー出力47 mWの体節の1つ(矢印)の1つで、13/14体節の段階で光活性化されました。活性化後、(d)ケージに入れられていないフルオレセイン-デキストランからの蛍光が観察されます。向き:背側(右)、腹側(左)。スケールバー100μm。

Figure 2.ケージに入れられたフルオレセイン-デキストランの免疫検出。図2は、18/19 hpfゼブラフィッシュ胚におけるケージ未使用のフルオレセイン-デキストランの免疫染色を示しています。10体節の段階では、図1で述べたのと同じレーザーパラメータを用いて、胚の小さな領域が側板中胚葉で活性化されました。免疫検出手順を使用して、矢印は最小限のバックグラウンド染色で活性化領域を特定します。向き:背側(上)、腹側(下)。スケールバー100μm。

ディスカッション

この論文では、ケージされたフルオレセイン-デキストランの光活性化に基づく単一細胞運命マッピングのための汎用性の高い方法について説明します。単一細胞におけるケージされたフルオレセイン-デキストランのアンケージングは、Zeiss LSM 510 META共焦点顕微鏡に結合されたMai Taiフェムト秒レーザーからの2光子吸収を使用して達成されます。光活性化細胞中のケージされていないフルオレセイン-デキストランは、簡単な免疫組織化学手順を使用して迅速に視覚化されます。

このプロトコルでは、ケージされたフルオレセイン-デキストランの光活性化のための2光子吸収波長は740nmです。この波長は、ケージ内のフルオレセイン-デキストラン注入野生型胚を光活性化することによって実験的に決定されました。レーザー励起波長は600〜800nmの範囲で変化し、活性化後のフルオレセイン蛍光の有無を定性的に決定しました。活性化後、740 nmが最も強いフルオレセインシグナルを生成することがわかりました。理想的には、740 nm はすべてのモデル システムで機能する必要があります。ただし、サンプルに最適な2光子励起波長を決定するために、さまざまな波長をテストすることをお勧めします。

ケージ内のフルオレセイン-デキストラン注入野生型胚では、テストされた2光子励起波長ごとに、平均レーザー出力も変化させました。励起波長740nmの場合、平均レーザー出力47mWは、低い平均レーザー出力と比較して、活性化領域でより強いフルオレセインシグナルを生成しました。平均レーザー出力が高いほど、より強いフルオレセインシグナルは生成されませんでしたが、組織のアブレーションが誘発されました。フェムト秒レーザーパルスは生体組織のアブレーションに効率的であるため¹⁵、組織アブレーションを回避する光活性化のしきい値平均レーザー出力を決定することをお勧めします。

二光子吸収は、小さな相互作用体積内で発生します。ケージされたフルオレセイン-デキストランの適切な活性化を確実にするには、細胞を適切な焦点にする必要があります。上記のプロトコルでは、GFP陽性細胞を白色光下で同時に画像化して、細胞の焦点を確認しました。したがって、他のチャネルに加えて白色光の取得が推奨されます。細胞の焦点を確認した後、私たちのプロトコルは、活性化された細胞を拡大することを提案します。ズーム係数は 50 から 70 が推奨されますが、この値は選択したセルのサイズによって異なります。ズームを大きくすると、活性化された細胞が隣接する細胞から分離され、2光子活性化のスキャン領域が制限されます。理想的には、スキャン領域はセルの広い領域をカバーする必要があります。

単一の活性化細胞を検出するには、バックグラウンド染色を最小限に抑える必要があります。上記の免疫検出プロトコルでは、サンプルをブロッキングバッファーで5〜6時間ブロックすることが重要です(ステップ4.13)。NBT / BCIPで開発する場合、ケージされていないフルオレセイン-デキストランは10〜20分で見えるはずです。バックグラウンド染色が強い場合は、ブロッキング時間を長くし、抗体を除去するための追加の洗浄をお勧めします(ステップ4.17)。

図1と図2は、光活性化と免疫検出の代表的な結果を示しています。図1では、初期の1〜2細胞期の野生型胚にケージされたフルオレセイン-デキストランを注射しました。胚は体体形成の中期に上昇し、横方向の低融点アガロースにマウントされました。図1(a、b)は、光活性化前の胚の明視野および蛍光画像を示しています。胚がケージに入れられていないという証拠は、図1(b)のフルオレセイン蛍光の欠如によって実証されています。体節内の小さな領域は、平均レーザー出力47mWを使用して、740nmの波長で31秒間活性化されました(図1(c;矢印)。活性化後、活性化領域からの蛍光によって示されるように、フルオレセイン-デキストランの2光子アンケージングが起こりました(図1(d;矢印)。体膜組織は無傷のままであったため、活性化はレーザーアブレーションを伴わなかった(図1(c)。図2は、ケージされていないフルオレセイン-デキストランの免疫検出を示しています。10体節期胚の外側プレート中胚葉の小さな領域は、図1に記載されているのと同じレーザーパラメータを使用して光活性化されました。胚は、ステップ4.1から4.20を使用して育てられ、処理されました。図2の矢印は、青色の沈殿物の蓄積によって示されるように、活性化された領域の位置を示しています。バックグラウンド染色を妨げることなく、活性化された場所のみが明確に検出されます。

溶液の調製:

1 x PBT(1 L)
100 mL 10 x PBS
BSA 2 g
10 mL 20 % トゥイーン

10 x PBS(1 L)
NaCl 80 g
2 グラム KCl
6.1 g Na₂HPO₄
1.9 g KH₂PO₄
ddH₂O〜1 L
pHから7.3まで

4%パラホルムアルデヒド(160mL)
32 % パラホルムアルデヒド (10 mL バイアル 2 本)
8 mL 20 x PBS
132 mL ddH₂O

APバッファー(50mL)
1 mL 5 M NaCl
2.5 mL 1 M MgCl₂
5 mL 1 M トリス pH 9.5
250 μL 20 % トゥイーン
41.25 mL ddH₂O

抗体溶液(1検体分)
5.5 μL アセトン粉末
40 μL PBT
0.8 μL LS
0.1 μL 抗フルオレセイン-AP抗体

2 % LS(1サンプルで360 μL)
7.2 μL 100 % LS
352.8 μL PBT

1 X ダニオーメディア (1 L)^‡
11.6 mL 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO₄
600 μL 1 M Ca(NO₃)₂
5 mL 1 M HEPES
ddH₂O〜1 L
pHを7.6に調整

^‡ ダニオーは、脱絨毛膜ゼブラフィッシュ胚を飼育するための理想的な塩溶液です。適切な浸透圧(ゼブラフィッシュの場合は~300 mOsm)の等張溶液であれば、他の培地を使用することもできます

NBTストック(1mL)
50 mg ニトロブルー テトラゾリウム
0.7 mL ジメチルホルムアミド無水物
0.3 mL ddH₂O

BCIPストック(1mL)
50 mg 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸
1 mL ジメチルホルムアミド無水物

NBT/BCIP開発ソリューション
1 mL APバッファー
4.5 μL NBT ストック
3.5 μL BCIP ストック

アセトンパウダー

1. 成魚を20匹選び、液体窒素で冷凍する。
2. 冷凍魚をすり鉢と乳棒で粉末にすりつぶします。
3. 魚粉を50mLの円錐形チューブに移します。
4. コニカルチューブに100%アセトンを充填します。チューブをボルテックスします。
5. チューブを最大回転数で10分間回転させます。上清を捨てます。
6. ペレットを100%アセトンでさらに3回洗浄し、チューブを最大回転数で10分間回転させます。最後の洗浄までに、上清は透明に見えるはずです。
7. ペレットに100%アセトンを再度加え、チューブを室温で放置します。密度の高い粒子は沈降し、微細な粒子は懸濁したままになります。
8. 微粒子を新しいチューブにデカントします。粉末溶液を別々のチューブに分注し、-20°Cで保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CMNBケージフルオレセイン SE	Invitrogen	C20050
10 kDa Aminodextran	Invitrogen	D1860
Zeba Desalt Spin Column	Pierce, Thermo Scientific	89889
低融点アガロース	Amresco	0815-100G
ホウ酸ナトリウム	Amresco	1131117-100G
Tricaineメチルスルホン酸/ MS222	研究用有機物	1347A
抗フルオレセイン-AP	ロシュ グループ	11376622
ブロッキングバッファー	ロシュ グループ	11 096 176 001
マレイン酸	Sigma-Aldrich	MO375-500G
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡 科学	15714
NBT	Sigma-Aldrich	I8377-250mg
BCIP	フィッシャーサイエンティフィック	PI-34040
マイクロインジェクター	ハーバード装置	PLI-2000
LabTek チャンバーカバーガラススライド	ナルゲ Nunc 国際	155380
プロテイナーゼ K	Invitrogen	AM2544
ラム血清	Invitrogen	16070096
LSM510 META NLO	カールツァイス株式会社
20X 0.8 NA エアアポクロマート対物レンズ	Carl Zeiss, Inc.
透明イエローフィルター	シアターハウス株式会社	Roscoluxフィルターシートカラー:312