マウス皮質ニューロンにおける軸索分岐のリアルタイム in vitro イメージング

要約

出典: Winkle, C. C., et al. 軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオでは、示差干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡を使用して、皮質ニューロンの軸索分岐をリアルタイムで観察するライブ イメージング技術を示します。タイムラプスビデオは、軸索の局所的なエキソサイトーシスと細胞骨格再構成を誘導するシグナル伝達分子であるnetrin-1処理の効果を捉えています。これらのプロセスは膜突起を開始し、成熟した軸索枝に発達し、ニューロンの発達についての洞察を提供します。

プロトコル

1. 軸索分岐の微分干渉コントラスト (DIC) タイムラプス顕微

鏡

注: このプロトコルは DIC を利用しますが、他の透過光顕微鏡法も同じ目的 (位相差など) に使用できます。

1. 2日間のin vitro(DIV)で、トランスフェクトされていないニューロンを含むガラス底イメージングディッシュを予熱した環境チャンバーに入れ、5%CO2と37°Cの湿った環境を維持します。最高の画質と解像度を得るには、60倍プランアポクロマート、1.4開口数(NA)DIC対物レンズ、高NAコンデンサーを備えた顕微鏡を使用します。
2. 透過光照明を使用して、眼鏡を通してニューロンを見つけるように焦点面を調整します。
3. イメージングソフトウェアのマルチエリア取得機能を使用して、少なくとも6つの細胞のXYZ位置を見つけて保存します。最良の結果を得るために、目的のニューロンが視野内に収まるようにステージを配置します。
   1. 250 ng/ml netrin-1で刺激し、「マルチエリア取得開始」を押します。各位置の画像を20秒ごとに24時間順次取得し、必要に応じて取得を一時停止し、焦点を合わせ直します。
4. Apps>Review Multi Dimensional Data>open ファイル名を使用して、イメージングソフトウェアで画像を確認します。イメージングセッション中に形成される安定した軸索枝(長さ20μm)を特定します。線描画ツールを使用して、軸索の基部から先端までの安定した軸索枝を測定し、20 μmの長さの認定を満たしていることを確認します。
   後に
   1. 枝が形成される領域で膜突起が始まったときのネトリン刺激後のフレーム番号と、初期の枝が長さが20μmに達したときのネトリン刺激後のフレーム番号をスプレッドシートに記録します。
   2. 突起と分岐形成の間のフレーム数に20秒を掛けて、分岐あたりの形成時間を計算します。

材料