マウス海馬におけるミクログリアダイナミクスのin vivo二光子イメージング

要約

出典:Kamei, R., et al.、マウス海馬におけるミクログリアのIn vivo慢性二光子イメージング。J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオは、海馬CA1(Cornu ammonis 1)と歯状回におけるミクログリアダイナミクスのin vivo二光子顕微鏡検査のセットアップとイメージングプロセスを実証し、最適な光学的アライメントと構造的完全性評価を保証します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. CX3CR1-GFPマウスを用いたミクログリアのin vivo慢性二光子イメージング

麻

1. 酔導入後、金属管の内部を滅菌生理食塩水で洗浄し、破片を取り除きます。海馬の白い肺胞がガラス越しに見え(図1A)、術後の出血などの合併症がないことを確認します。
2. 次の手順でマウスを二光子顕微鏡下にセットします:
   マウス
   1. を二光子顕微鏡の対物レンズの下のヘッド保持装置と電動XYスキャンステージにセットします。熱サポートには加熱パッドを使用してください。この品質チェックには最大 30 分かかる場合があるため、麻酔の深さを監視して調整してください。手記： 作動距離(WD)が3mm以上、開口数(NA)が高い水浸対物レンズをお勧めします。対物レンズの補正カラーは、ガラスと生体材料の間の屈折率の不一致を補正することで解像度を向上させることができます。
   2. ガラスと対物レンズの間のスペースを水で満たし、気泡ができないように特に注意してください。必要に応じて、より多くの水を保持するプラスチックフィルムを使用して金属板の領域を拡大し、対物レンズのフロントレンズ全体を覆います。
   3. 脳内で発現する蛍光プローブの励起のために波長920nmのフェムト秒パルスレーザーをオンにし、画像取得ソフトウェアを開始します。
   4. 電動ステージと電動フォーカスシステムを使用して、CA1(Cornu Ammonis 1)にフォーカスを調整します。パルスレーザーによる連続照明下で、脳実質から発せられる蛍光と金属管の端からの反射光の誘導を受けて、ターゲット構造を位置決めします。
   5. 電動フォーカスシステムで焦点を調整することで、ガラス底に接触する脳実質の深さを測定します。さまざまな水平位置の深さを比較して、ガラス底と撮像面の位置合わせを判断します。
      1. ガラス底が撮像面と平行になるまでヘッド保持装置を傾けて、マウスヘッドの角度を調整します。
   対
   6. 物レンズの補正カラーを調整して、CA1のターゲット構造の深さで最高の解像度を実現します。
3. 海馬の二光子励起によって得られた画像の品質と強度を確認します(図1B)。
   注:画像の劣化は、脳内の組織損傷の存在を示します。
4. ミクログリアがすでに分岐した形態を回復していることを確認します(図1C)。
   注:ミクログリアのイメージングデータは、ミクログリアが基礎状態に戻るには少なくとも3〜4週間必要であることを示しています。
5. 実験の特定の目的のために、CA1の任意の層でin vivoイメージングを実行します。

結果

図1: 慢性期のCX3CR1-GFPマウスにおけるミクログリアのin vivoイメージング。(A) 慢性期の右背側 CA1 (Cornu Ammonis 1) に移植された窓の代表的な外観。ガラスの底を通して、術後の出血なしに肺胞の白い繊維がはっきりと観察されます。DHCとLVは、それぞれ尾内側領域と吻外側の端に部分的に見えます。スケールバー、1 mm。(

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フェムト秒パルスレーザー	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	A Ti:Sapphire レーザーは、920 nm 波長で使用されます。
CA1イメージング用の	2光子顕微鏡	Nikon	A1R MP+
2光子イメージング用対物レンズ	オリンパス	XLPLN25XSVMP	25×対物レンズで、作動距離が長く、開口数が多く、補正カラー
製のアルミニウム製	重	CP-1	プレートは、頭部固定用です。
円形ガラスカバーガラス	松波ガラス	3φ No.1	ステンレス管に接着したカバーガラス。
CX3CR1-GFPマウス	クソン研究所	8451	クログリアイメージング用のトランスジェニックマウス。
円筒形ステンレス鋼管	MORISHITA	Custom-made	Metalチューブを埋め込みます。外径3.0mm、内径2.8mm、高さ1.7mm。
歯科用レジンセメント(スーパーボンドC&B)	Sun Medical	204610555	科用セメント。
ヘッド保持装置	Narishige	MAG-2	角度調整器付きマウスのヘッド保持装置
加熱パッド	バイオリサーチセンター	BWT-100A および HB-10	手術中にマウスに温熱サポートを提供するツール。
加熱パッド	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 および Hot-1	ヘッド保持装置のマウスを熱サポートします。
ケタミン (Ketalar)	第一三共株式会社	S9-001665	手術中の麻酔。
眼科用軟膏	佐藤製薬		手術中の目の乾燥を防ぐために使用します。
ポビドンヨードスクラブ液	治精化製薬	2612701Q1137	手術部位の消毒に使用します。
実体顕微鏡	Leica Microsystems	S8 APO	手術用顕微鏡。
滅菌生理食塩水	塚製薬工場	3311401A2026	手術中の洗浄液。
滅菌防水パッド	AS ONE	8-5945-01	手術用プラットフォーム。
キシラジン (セラクタル 2%)	手術中のバイエル		麻酔。

顕微鏡。が特徴です アルミニウム 成 ジャミ歯 ツールは、 明大