共焦点顕微鏡を使用したマウス神経終末の高速カルシウム過渡現象のイメージング

要約

出典: Zhilyakov, N. V. et al., 共焦点顕微鏡を使用した高時間分解能によるマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の登録。J. Vis. 経験。(2021年)

このビデオは、共焦点顕微鏡を使用して神経終末での高速カルシウム過渡現象を記録するイメージング技術を示しています。神経を刺激し、カルシウム結合色素からの蛍光変化を捉えることで、神経終末での動的なカルシウム流入とクリアランスを視覚化し、シナプス活動と神経筋シグナル伝達に関する正確な洞察を提供します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

実験

は、マウスBALB / C(20〜23 g、生後2〜3か月)からの長耳挙筋(m. LAL)の単離された神経筋製剤で実施されました。

1. リンゲル液およびファイリング液の調製

塩

1. 化ナトリウム、NaCl (137 mM)、塩化カリウム、KCl (5 mM)、塩化カルシウム、CaCl₂ (2 mM)、MgCl₂ (1 mM)、NaH₂PO₄ (1 mM)、NaHCO₃ (11.9 mM)、およびグルコース (11 mM) の成分を混合して、哺乳類の筋肉用のリンゲル液を調製します。95%の酸素(O₂)と5%の二酸化炭素(CO₂)で溶液を泡立て、必要に応じて塩酸/水酸化ナトリウム(HCl / NaOH)を加えてpHを7.2〜7.4に調整します。
2. 染料ローディング溶液を準備します。
   1. pH 7.2-7.4 の範囲で (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES) (10 mM) 溶液を調製します。500 μg の市販の色素は 500 μL のバイアルに入っています。色素を14 μLのHEPES溶液に溶解して、30 mMの色素濃度を得る。よく振って、完全に溶解するまで遠心分離します。
   2. Ca²⁺ 指示薬の溶液を HEPES 溶液で 1 mM 濃度まで希釈します。冷凍庫(-20°C)に保管し、光にさらさないでください。

2.染料ローディング手順

注

:色素ローディング手順は、以前に公開されたプロトコルから適応された、神経断端を通るローディングのプロトコルに従って実行されます。

1. 以前に公開されたプロトコルに記載されているように、この準備の解剖手順に従って LAL 筋を解剖します。
   1. エラストマーでコーティングされたペトリ皿にわずかに伸ばされた組織(初期長さから30%以下)を細いステンレス鋼のピンで固定し、筋肉が完全に覆われるまでリンゲル液を加えます。
      注:ペトリ皿には、製造元の指示に従ってエラストマーがあらかじめ充填されています( 材料表を参照)。
2. 充填ピペットを準備します
   1. マイクロピペットプーラー( 材料表を参照)を使用して、細胞内記録用にできるだけ鋭い先端のマイクロピペットを準備します。内部フィラメントのないキャピラリー(外径1.5mm、内径0.86または1.10mm)を使用してください。
   研磨
   2. 剤でテーパーに切り込みを入れた後、マイクロピペットチップを折り、チップを直径約100μmまで開いたままにします。内径が>80μmから12-13μmに縮小するまで、先端を火磨きします。充填ピペットの片側にシリコンチューブを取り付け、反対側に注射器(針なし)を取り付けます。
3. 実体顕微鏡下で、神経幹が別々の神経枝に変わる場所を見つけます。取り付けられたチューブとシリンジを備えた充填ピペットをワックスを使用してペトリ皿の上に置きます。ピペットチップが神経の上に立つまで動かします。
4. 細いはさみで、筋線維の近くで神経を切り、長さ約1 mmの神経断端の小片を残します。神経断端をリンゲル液と一緒に、つままずかずに充填ピペットの先端にそっと吸引します。充填ピペットからシリコンチューブを取り外します。
5. 長いフィラメントのシリンジを使用して、色素ローディング溶液(~0.3 μL)をある程度引き出します。この体積はフィラメントの約3cmに相当します。
   注:最初に、アルコールランプまたはガスバーナーを使用して火を引っ張って、ピペットチップから10μLの容量のフィラメントを作成する必要があります。
6. ローディング溶液の入ったフィラメントチップを充填ピペットにそっと挿入します。混合物を神経断端に直接放出します。製剤を室温で暗所で30分間インキュベートします。
7. その後、調製物を新鮮なリンゲル液ですすぎ、50 mL(またはそれ以上)のリンゲル液を入れたガラスビーカーで25°Cで最大2時間インキュベートします(調製物は溶液で覆われている必要があります)。この間、染料はシナプスに到達します。

3.共焦点顕微鏡によるビデオキャプチャ

注:カルシウム過渡現象のレジストレーションは、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で実行されます( 材料表を参照)。高速カルシウム過渡現象を登録するために、十分な空間的および時間的分解能で信号を記録できる独自のプロトコルが使用されました。顕微鏡には、20倍の水浸対物レンズ(開口数(NA)1.00))が装備されていました。488 nmのレーザーラインを10%の強度に減衰させ、503〜558 nmの発光蛍光を収集しました。

1. 製剤をシリコンエラストマーでコーティングされた実験チャンバーに取り付け、スチール製のマイクロニードルのセットでわずかに伸ばして固定します。製剤をリンゲル液で広範囲にすすぎます。
   注:チャンバーの底をエラストマーで覆った有機ガラス製のシンプルなカスタムメイドの灌流実験チャンバーを使用しました(製造元の指示に従って調製、 材料表を参照)。チャンバーには溶液供給チューブがあります。溶液は、磁気ホルダーに取り付けられたシリンジニードルを介してポンプで排出されます( 材料表を参照)。実験室として、ペトリ皿(製剤のインキュベーションに使用されるものと同様)を使用することもできますが、供給チューブと吸引チューブが取り付けられています。
2. 神経を刺激するために使用される吸引電極を取り付けます。
   注:電極を浴槽の横にワックスをかけて配置して固定します。先端を神経断端に近づけ、電極に吸引します。
3. 調製チャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、入口と出口のフィッティングをチャンバーに配置します。
4. 製剤を灌流するには、単純な重力流駆動システムを使用します。灌流吸引ポンプをオンにして、余分な溶液を取り除きます。
5. 刺激吸引電極を電気刺激装置に差し込み、刺激後に筋肉の収縮が起こるようにします。刺激条件と記録については、セクション3.9〜3.12を参照してください。
6. 灌流システムをd-ツボクラリン(10μM)を含むリンゲル液で満たします。
   注:この溶液は筋肉の収縮を防ぐのに役立ちます。シナプス後膜上のニコチン性アセチルコリン受容体のD-ツボクラリンまたはα-ブンガロトキシン特異的遮断薬は、筋肉の収縮を完全または部分的にブロックします50。また、筋肉収縮を防ぐために、μ-コノトキシンGIIIBなどのシナプス後ナトリウムチャネルの特異的遮断薬を使用することができます51。
7. 灌流吸引ポンプのスイッチを入れ、d-ツボクラリンを含むリンゲル液で製剤の灌流を開始します。
8. LSCMソフトウェアでイメージングパラメータを次のように設定します。
   1. LSCMソフトウェア(LAS AF、 材料表を参照)で、電気生理学を選択します。
      注:このモードでは、画像が時点でキャプチャされると、トリガーボックスを使用して同期パルスが刺激装置に送信されます。これにより、調製物で活動電位の生成が誘発されます(図1;刺激装置ユニット)。
   [
   2. 取得モード]を選択します。顕微鏡同期パルスを使用して刺激装置をトリガーするには、ジョブメニュー設定でトリガー設定を選択します。[Trigger Out On Frame] フィールドを out1 チャンネルに設定します。
   3. 次の設定を使用します: スキャンモード: XYT、スキャン周波数: 1400 Hz、ズーム係数: 6.1、ピンホール: 全開。シーケンシャル トランスパス双方向 X モードがオンになっていることを確認します。
   4. フレームを形成する最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生ビデオに収集するフレームを 20 フレームに設定します。
      注: これらの設定により、128 x 128 ピクセルの解像度で画像をキャプチャし、52 ミリ秒ごとに 1 フレームを撮影できます。
   5. アルゴンレーザーの励起波長を出力の8%で488nmに設定します。

ライブモードボタンを押すと、染料がロードされた神経終末のプレビューを取得するのに役立ちます。

9. 刺激ユニット
   注: このデバイスを使用すると、MATLAB ソフトウェアを介して刺激の時間パラメータを設定できます。
   1. 新しいファイルを作成し、上記の記事のコードを MatLab コード ウィンドウに貼り付けて、ファイルを保存します。[実行]をクリックすると、刺激パラメータを含むウィンドウが表示されます。刺激の遅延時間と持続時間を設定します。
      注:遅延は、再構成された蛍光シグナルの時間分解能を決定します。0.2msの電気パルスが遅延され、絶縁ユニットに送られます。後者は、刺激パルスの振幅と極性を形成し、生物学的物体を記録装置から電気的に分離します。
   2. 神経を刺激するには、刺激インパルスの超最大振幅を選択します(すべての神経線維を活性化するために必要な最大刺激強度より25%〜50%大きい)。
      注:提示された方法は、スイープを最小限に抑えたLSCMを使用して単一の高速蛍光信号を記録するための特別なアルゴリズムに基づいています。開発されたアルゴリズムの各ステップで、記録された蛍光信号は、顕微鏡のスイープよりも短い時間間隔で前の蛍光信号からシフトされます。時間シフトの値によって、必要な信号の時間分解能が決まります。アルゴリズムのステップ数(シフト)は、必要な時間分解能と元の時間分解能によって異なります。この登録方法では、製剤の刺激は0.25Hzの周波数で行われる。
10. ライブモードでは、ROIを検索し、最適な焦点を取得します。データ収集ソフトウェアを実行します。
11. 刺激装置の遅延を前の値に対して2ms遅くシフトし、データ収集ソフトウェアを実行します。
12. ステップ3.11を26回繰り返して26個のシーケンスを取得し、各シーケンスを前のシーケンスから2msシフトします。

結果

図1:実験的なセットアップの概略図。 1.レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)。2. LSCM(トリガーボックス)の同期モジュール。3.刺激装置。4.絶縁ユニット。5. 生物学的サンプル。6.神経の電気刺激のための吸引電極。7.灌流システム(7a:灌流液リザーバー、7b:スポイト、7c:フローレギュレーター、7d:真空フラスコ)。矢印は、同期パルスの伝播方向を示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キャピラリーガラス	Clark Electromedical instruments、英国	GC150-10
共焦点および多光子顕微鏡システム ライカ TCS SP5 MP	ライカ マイクロシステム、ハイデルベルク、ドイツ
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー P 97	サッター機器、米国	P-97
フローレギュレーター	KD Medical GmbH 病院製品、ドイツ	KD REG	フローレギュレーター付き使い捨て輸液セット
HEPES	Sigma-Aldrich、米国	H0887	100mL
照明システム ライカ CLS 150X	ライカ マイクロシステムズ、ドイツ
吸引付き磁気ホルダーチューブ	BIOSCIENCE TOOLS, USA	MTH-S
Microspin FV 2400	Biosan, Latvia	BS-010201-AAA
Minutien Pins	Fine science tools, Canada	26002-20
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latvia	BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt	Molecular Probes, USA	O6806	500μg
ピペット	Biohit, Russia	720210	0.5-10 μL
ピペットチップ	Biohit, Russia 781349		10 μL
粘土	地元生産者
使い捨て皮下注射針	Bbraun	100 Sterican	0.4×40 mm
スプレッドシートプログラム	Microsoft, USA	Office Excel
実体顕微鏡、ライカM80	カマイクロシステムズ、ドイツ
電極			http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184エラストマー	Dow Corning、米国
リンジ	現地生産者		0.5 mL
シリンジ	地生産者		60 mL

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