脱髄マウスモデルにおける浸透圧ポンプベースの神経治療薬送達

要約

出典: Wang, X. et al., 中枢神経系の In Vivo 再ミエリン化研究のための浸透圧ポンプベースの薬物送達。J. Vis. 経験。(2021年)

このビデオでは、脱髄マウスモデルで浸透圧ポンプを使用して神経治療薬を送達する方法を示します。制御された薬物放出は、脳梁内のミエリン産生細胞を活性化することにより、再ミエリン化を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. リゾレシチン誘導脱髄マウスモデルの確立

1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を含む 1% リソレシチン (L-α-リゾホスファチジルコリンとも呼ばれます) 溶液を調製します。
は
2. さみ、鉗子、湾曲止血剤、その他の手術器具をオートクレーブ滅菌で滅菌します。手術部位を滅菌し、滅菌シートを敷きます。手術に使用されるすべての材料と試薬は、無菌状態で準備する必要があります。手術中は手術領域を無菌状態に保つことが重要です。
3. 生後56日目(P56)C57BL6マウスを次のように麻酔します。
   マウス
   1. を小動物麻酔器のイソフルランチャンバーに入れます。O₂流量を300〜500 mL/分に調整し、イソフルランを3%〜4%に調整します。十分な麻酔後、マウスがゆっくりと安定した呼吸で動かなくなったら、マウスを温熱パッドを備えた定位固定装置に移します。
   2. チャンバーからのガス出力を麻酔マスクに切り替え、イソフルランを1%〜1.5%に調整して、マウスを麻酔状態に維持します。マウスが完全に麻酔されるまで待ってから、ケトプロフェン(3〜5mg / kg)を腹腔内に注射して痛みを和らげます。手術前に、マウスのつま先をつまんで反応を確認し、麻酔が成功したことを確認します。
   3. マウスが麻酔されると、体温を調節できなくなります。したがって、手術中はマウスの体温を監視し、調節してください。マウスの眼球の表面をエリスロマイシン眼軟膏で覆い、麻酔下で眼球を湿らせます。
4. マウスヘッドを歯のバーとイヤーバーで定位固定装置に固定します。(図1A)。
5. カミソリを使って頭のてっぺんの毛を取り除きます。ベタジンと75%エタノールの3サイクルで頭の皮膚を消毒します。倫理的な懸念のために、手術部位を除く動物の体を覆います。メスを使用して、首の付け根から目の間まで皮膚の長さ1cmの中央矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させます(図1B)。
6. 30%過酸化水素を含む滅菌綿棒で頭蓋骨の表面を優しく拭き、頭蓋縫合糸を視覚化します(図1C)。矢状縫合糸が水平になるように、歯棒とイヤーバーの高さを調整して、ラムダ点とブレグマ点を同じ高さ(つまり、針先が点に接触したときの同じz軸座標)に配置します。
7. マイクロリットルのシリンジ針(10 μL、33 G)の先端をブレグマポイントにそっと置き、x、y、およびz座標を0にリセットします(図1D)。デジタル読み出しのプロンプトに従って、注射器を注射部位(x:1.04、y:1.0、つまり、正中線の外側1.04 mm、ブレグマポイントの後方1.0 mm)に移動します(図1E)。
8. 1 mLのシリンジ針(26 G、0.45 mm)で硬膜を貫通せずに、注射部位の頭蓋骨に小さなバリ穴をゆっくりと開けます(図1F)。特定の深さに達するまで、マイクロリットルの注射器針を穴から脳組織にゆっくりと挿入します(ほとんどのP56マウスではz = -1.62 mm)(図1G)。
   注:経験的には、-1.62 mmの挿入深さにより、針先がほとんどのP56マウスの脳梁の中央に到達し、リゾレシチンを脳梁に直接送達して脱髄を誘導することができます。
9. 1.5 μLの1%リゾレシチンを0.3 μL/分の速度で注入します。注射後、5分間待ってからマイクロリットルの注射器をゆっくりと引き抜き、注射針の経路に沿った液体の漏れを防ぎます。
10. 5-0の外科用縫合糸で皮膚を縫合します(図1H)。
11. 体温の低下を避けるために、マウスを加熱パッドの上に置きます。痛みを和らげるために、24時間ごとに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。傷が適切に治癒するように、切開部に毎日エリスロマイシン軟膏を塗布します。手術を受けたマウスをケージの中に一人で入れ、完全に回復するまで湿った餌を与えます。手術後は毎日マウスを監視してください。

2. 浸透圧ポンプの準備

注

: ポンプの主要コンポーネントを図 2A に示します。

1. 脳注入カニューレの脳への挿入深さを決定します。使用する脳注入カニューレの針の長さが 3 mm、各深さ調整スペーサーが 0.5 mm であることを確認してください。1.5 mm(脳梁に近い)の注入深さを達成するには、3つの深さ調整スペーサーを組織接着剤で脳注入カニューレの針に取り付けます(図2B、C)。
2. 浸透圧ポンプを充填するには、ポンプパッケージに付属のシリンジ針を1mLのシリンジに取り付け、薬剤を吸引します。ポンプを直立させ、シリンジをポンプ上部の開口部に挿入し、気泡を作らないように注意しながらゆっくりと薬剤を注入します(図2Dを参照)。液体が開口部から流れ出たら、シリンジをゆっくりと引き出します。
フローモデレーターを
3. 曲げたり押しつぶしたりしないように注意しながら、はさみまたはペンチでフローレギュレーターから白いフランジを取り外します。次に、フローモデレーターをポンプに挿入します(図2E)。浸透圧ポンプに気泡があるかどうかを判断するには、充填の前後に浸透圧ポンプを別々に計量します。
4. カテーテルを動物の大きさに応じて一定の長さにトリミングします(体重約25gのP56マウスの場合は20〜25mmのカテーテル)。カテーテルを脳注入カニューレに取り付けます。
5. 空気を導入せずにシリンジを使用してカテーテルに薬剤を充填します(図2F)。
6. カテーテルをフローモデレーターに接続します。取り付け後、カテーテルが露出したフローモデレーターの約4mmを覆っていることを確認してください(図2G)。
7. 浸透圧ポンプが移植後すぐに機能できるようにするために、充填されたポンプを滅菌0.9%生理食塩水またはPBSに37°Cで少なくとも4〜6時間(できれば一晩延長)浸漬し、組織環境と同じ浸透圧を持つ溶液でポンプ表面の半透膜を事前に濡らします(図2H)。
8. ポンプに投入されるすべての溶液は無菌でなければなりません。ALZETポンプは、滅菌用量のコバルト60にさらされた後、無菌状態で供給されます。ただし、外部の汚染が発生した場合は、ポンプの表面をイソプロピルアルコール(水中70%)で拭くことで洗浄できます。

3. 浸透圧ポンプの移植

脳

1. 梁脱髄モデルの確立後 3 日間待ちます。小動物麻酔システムをオンにします。はさみ、ピンセット、止血ペンチを消毒し、75%アルコール溶液に浸します。手術部位に滅菌シートを敷きます。
マウスを
2. 麻酔し、定位固定装置に再度固定します。乾燥を防ぐために眼球の表面を眼軟膏で覆います。
3. 元の傷を75%アルコールで消毒します。以前に縫合した外科的切開部を開き(図3A)、切開部を肩甲骨まで拡大します(図3B)。
4. 肩甲骨の止血ペンチまたはピンセットで皮下結合組織から皮膚を分離し、空洞を開きます(図3C)。浸透圧ポンプをキャビティに入れます(図3D、E)。
5. 綿棒で、脱髄モデルを確立するときに作成された頭蓋骨の表面のピンホールを優しく拭き、露出させます(ステップ1.8を参照)。脳注入カニューレをこのピンホールから垂直に挿入し、組織接着剤で頭蓋骨にすばやく固定します(図3F)。
6. はさみで脳注入カニューレの上にある取り外し可能なタブを取り外します(図3G、H)。または、このプロセス中に揺れないように、カニューレを挿入する前にまずタブを取り外してください。
7. 切開部を縫い合わせるか、組織接着剤で貼り付けます(図3I)。
8. 手術後は、体温の低下を避けるためにマウスを加熱パッドの上に置きます。痛みを和らげるために、24時間ごとに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。傷が適切に治癒するように、切開部に毎日エリスロマイシン軟膏を塗布します。動物を一人でケージに入れ、完全に回復するまで湿った餌を与えます。

結果

図1:リゾレシチン誘発脱髄マウスモデルの確立。(A)定位固定装置にマウスを固定します。(B)1cmの矢状面中央切開を開き、頭蓋骨を露出させます。(C)頭蓋縫合糸を視覚化します。(D) ブレグマ点のx、y、z座標を0にリセットします。(E)注射器を注射部位に移動します。(F)注射部位の頭蓋骨に穴を開けます。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔エアポンプ	RWD	R510-29	E05818-006
脳注入キット 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg 24 時間ごとに
エリスロマイシンの眼軟膏	ロングテクノロジー	YCKJ-RJ-024780	麻酔中に眼球の表面を覆
エリスロマイシン軟膏	pythonbio	RG180
ガス排出装置	RWD	R546W	E05518-002
L-α-リゾホスファチジルコリン	シグマ	L0906	滅菌PBS
マイクロリットルシリンジ	ミルトン	65460-05	シリンジシリーズ:1700、10 μL、33 ゲージ
小浸透圧ポンプ モデル 1002	ALZET	4317	0.25 μL/時、14 日間
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
ペントバルビタールナトリウム	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg 安楽死用腹腔内注射
動物麻酔機	RWD	R520IE	E05807-006 M
定位固定装置	RWD	E06382
STERI 250 滅菌器	ケラー	31101	手術器具の迅速滅菌
外科用縫合糸	上海 jinhuan	F504	5-0
シリンジ針 (1 mL)	上海 KDL	6930197811018	26 ゲージ (0.45 mm x 16 mm)
試験薬剤および溶媒	実験依存	N/A
サーモスター恒温モニタリングシステム	RWD	69026	麻酔中の体温維持
Vetbond 組織接着剤	3M	1469SB	脳注入カニューレを固定し、皮膚切開部を接着します。

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