ラット中枢神経系への試験化合物のくも膜下腔内送達

要約

出典: Chen, Y., et al.ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのくも膜下腔内送達J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオは、ラットモデルの腰椎柱に埋め込まれたカテーテルを介して脳脊髄液(CSF)に試験化合物を送達する方法を示しています。この化合物はCSFに沿って脳と脊髄に循環し、ニューロンに入り、治療の可能性を提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.手術

ラ

1. ットを50 mLの円錐形チューブで支えて、骨盤の上の筋肉の間の2つの自然な穴を特定します(図1Aの矢印)。片手でそれらの穴を持ち、もう一方の手で背骨を尾側から吻側方向に優しく押して感じ、椎骨間の最初の大きなくぼみを見つけ、これが仙骨1(S1)と腰椎6(L6)椎骨の間の椎間腔です(図1B)。
2. 吻側に少し動かして、次のくぼみ、腰椎5(L5)とL6椎骨の間の椎間腔、および注射部位(図1Aの*)を特定します。メスを使用して、注射部位が切開の中心になるように、吻側から尾側までの正中線に沿って皮膚に2cm以下の長さの切開を行います(図1Aの点線)。
3. 解剖はさみを使用して結合組織を解剖し、筋肉層を視覚化します。次に、L6腰椎の背側脊椎突起のすぐ外側の筋嚢に1cmの切開を行います。
   注:この時点で、L6腰椎の骨を視覚化できます。
4. ガイドカニューレ針アセンブリを第 6 腰椎の前方近くに配置し、針の端が脊柱管を貫通するように、第 6 椎骨の前方に沿って椎間腔に押し込みます。ガイドカニューレを針に沿って所定の位置に押し込み、ガイドカニューレだけを所定の位置に残して、23-G針を取り外します。
   注:針を挿入する前に、鈍い鉗子を使用してL6腰椎の背側突起の位置を特定すると役立ちます。一般に、脳脊髄液(CSF)液が針ハブに入るのが見られます(この液体は血のヒントを帯びている場合がありますが、これは害が及んだことや針が正しく配置されていないことを示すものではありません)。著者らは、この処置中に大量の血液や重度の出血は見られなかった。いずれかが発生した場合は、獣医師に連絡して、適切な治療法と動物を安楽死させる必要があるかどうかを決定する必要があります。
5. カテーテルワイヤーアセンブリをガイドカニューレに挿入します。カテーテル ワイヤー アセンブリを脊柱管に対して約 45° の角度で傾け、端を脊柱管に約 0.3 cm 押し込みます。
6. ガイドカニューレを取り外し、スタイレットワイヤーを所定の位置に置いたカテーテルを残します。図2Bviに示すように、カテーテルのくも膜下腔内先端から約2.5 cmのスタイレットワイヤーを取り外し、2 cmのマークが管の入り口(筋肉のすぐ下に見える)になるまでカテーテルを脊柱管に進めます。
   注:挿入されたカテーテルは、くも膜下腔に吻側に伸びる必要があります。配置が成功すると、カテーテルがその空間内で自由に動くことができるはずです。
7. スタイレットワイヤーを完全に抜くと、CSFが移植されたカテーテルに入るのが見られる場合があります。
8. デリバリーカテーテルアセンブリを、30 G針端を介して移植されたカテーテルの遠位端に接続します(図2Bv、vi)。
9. 60 μLの滅菌生理食塩水を100 μLのシリンジ(フラッシングシリンジ)にロードします。30 μLの試験化合物(アンチセンスオリゴヌクレオチドやASO溶液など)のボーラスを2番目のシリンジ(注射用シリンジ)にロードします。
10. フラッシングシリンジ(生理食塩水を充填)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプター端に接続します(図2Bv)。20 μLの滅菌生理食塩水をくも膜下腔内に注入します(注射前フラッシング)。
11. 注入シリンジ(試験化合物が充填されている)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプター端に接続します(図2Bv)。30 μLの試験化合物を30秒かけてくも膜下腔に注入します。
    注:ASOのルーチン注入量は30 μLで、脊髄と皮質で良好なノックダウンを達成します。注入量が化合物の分布に影響を与える可能性があることが報告されていますが、異なる注入量はテストされていません。別の化合物または容量を使用する場合は、安全性と有効性を経験的に決定する必要があります。
12. ステップ1.10を繰り返し、カテーテルをさらに40 μLの滅菌生理食塩水で洗い流します(注射後のフラッシング)。次に、移植されたカテーテルからデリバリーカテーテルアセンブリを取り外します。
    注:注射前および注射後のフラッシュは、化合物の局所隔離を減らし、吻側構造への分布を改善すると考えられています。
13. 埋め込まれたカテーテルを無菌的に切断してヒートシールするには、一対の滅菌解剖鉗子をビーズ滅菌器に非常に熱くなるまで入れてから、鉗子のホットエンドでチューブをクランプします。
    注:この動作によりカテーテルが溶けます。したがって、チューブの穴が崩壊し、すべての側面が互いにくっつき、チューブが無菌的に密閉されます。次に、皮下腔に入れます。
14. 吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、残りのヒートシールカテーテルを結合組織に固定します。次に、非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、固定されたヒートシールカテーテルの上の皮膚を閉じます。
    注: 創傷クリップは、施設動物管理および使用委員会 (IACUC) プロトコルによって承認されたとしても使用できます。この技術は繰り返しの注射にも対応していますが、私たちの手に 1 回限りの注射にのみ使用されています。反復注射の実現可能性は、IACUC の承認を得て経験的に評価する必要があります。
15. ガーゼと生理食塩水を使用して皮膚から血液を洗い流し、動物が可動になるまで加熱されたインキュベーターで麻酔から回復し、その時点でホームケージに戻されます(ケージあたり2匹のラット)。
    注:同じ日に複数のラットに手術を行う場合は、水を使用してツールを洗浄して血液を取り除き、加熱した乾式ビーズ滅菌器を使用して再滅菌します(少なくとも20秒間、 冷える時間付き)動物間。5匹ごとに新しい器具セットが使用されます。
16. IACUCプロトコルに従って、手術後少なくとも3日間は毎日動物を監視し、手術後も毎週監視を続けます。

結果

図1:注射部位と切開線の識別。(A)ラットの腹部を50 mLの円錐形のチューブで支えていると、骨盤の上の筋肉間の2つのくぼみが容易に見えます(矢印)。(B)片手でピットを持ち、もう一方の手で脊椎を軽く押して感じ、L5椎骨とL6椎骨の間の椎間腔、つまり注射部位を見つけます(パネルAの*)。パネルAの点線は、注射部位を中心とする切開線を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD intramedic PEチューブ		ポリエチレンチューブPE50、直径0.023	BD 427400(10フィート、Fischer Scientific 22-204008)または427401(100フィート、Fischer Scientific 14-170-12P)
intramedic PEチューブ		ポリエチレンチューブPE10、直径0.011インチ	BD 427410(10フィート、フィッシャーサイエンティフィック14-170-11B)または4274011(100フィート、フィッシャーサイエンティフィック14-170-12B)
BD PrecisionGlideシングルユースニードル30G	BD		BD
ガイドカニューレ		19G x 1 WT(1.1 mm x 25 mm)ニードル	305186
ハミルトンシリンジ100 ul	ハミルトン社	ミルトンシリンジ100 ul
ビーズ滅菌器	インサイエンスツール滅		菌器モデル番号FST 250
ポビドン スクラブ	PDI		S48050
生理食塩水	バクスター	塩化ナトリウム 0.9% 静脈内注入 BP 50 ml	FE1306G
ス	フェザー	使い捨てメス	No. 10
動物加熱パッド	K&H 製造		モデル番号 1060
スタイレット ワイヤー	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
手術用タオルドレープ	Dynarex		4410
手術用ハサミと鉗子	FST および Fisher Scientific
縫合糸	Ethicon		4-0 または 5-0
この手順
投与カテーテルシステム	SAI 輸液システム		RIDC-01
ガイドカニューレ	SAI 輸液システム		RIDC-GCA
内部カテーテル	SAI 輸液システム		RIDC-INC
スタイレットワイヤー	SAI 輸液システム		RIDC-STY

BD BDBD 305128BD BD ハホットファ メ 小用の既製および滅菌材料の代替供給源