ポジショニングデバイスを使用したマウス脳へのsiRNAの鼻腔内送達

要約

出典: Ullah, I., et.al.中枢神経系への鼻腔内siRNA送達中のマウスの配置のための位置決め装置J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、特殊な位置決め装置を使用して、ニューロンを標的とするペプチド-siRNA複合体をマウスの脳に送達するための正確な鼻腔内投与技術を示します。麻酔をかけたマウスは、肺のドレナージを防ぎながらsiRNA吸入を最適化するために、頭を下にして前方に固定します。標的ペプチドは、ニューロンにおける受容体を介した取り込みを促進し、脳内での標的siRNA送達と遺伝子サイレンシングを可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの配置<

p style='margin-left:40px;'>1.手術面を維持するために、ペダル反射(つま先をしっかりとつまむ)によって麻酔のレベルを評価します。

2. 必要なすべての試薬に簡単にアクセスできるように、位置決め装置を適切な距離と高さに配置します。

3. マウスに適切な麻酔がかけられたら、親指と人差し指で各マウスの首筋をそっと持ち上げ、指定された椅子に置きます。

4. この段階では、椅子にマウスを適切に配置することが非常に重要です。マウスの背もたれを椅子の背もたれサポートと平行に置き、椅子の座面に対して 90° に置きます。図1Bに示すように、マウスから手を離し、動物を押したり押したりせずに、頭を下げたり前かにしたりせずに自然に横たわらせます。動物がこのリラックスした姿勢にある間、マウスに不快感を与えることなく、マウスの前肢が自然なサポートを提供していることを確認してください。

5. マウスの適切な位置が整ったら、マウスを椅子ベルトで固定し、すぐに鼻腔内接種を開始します。

2.鼻腔内(IN)送達

注

:このプロトコルは、マウスポジショニングデバイスを使用したRVG9R:siRNA複合体のIN送達を記述しています。このプロトコルを使用すると、最大20〜30 μLの溶液を2 μLの滴で各マウスに容易に投与できます。この体積はマウスの鼻腔の体積である0.032 cm³よりも小さいため、この処置は致死的な鼻孔閉塞や窒息を引き起こしません。このプロトコルにより、デバイスごとに少なくとも 4 匹、最大 8 匹のマウスを同時に接種できるため、時間が最適化され、ばらつきが軽減されます。

1. 10 μLマイクロピペットを取り、2 μLに調整します。

2. マイクロピペットに2 μLのRVG9R:siRNA複合体溶液(例えば、5.2 μgのsiCy5と104 μgのRVG9R複合体、および13.5 μgのsiSOD1と270 μgのRVG9R複合体をサイレンシング実験に、5%グルコースを含む25 μLのPBSの最終容量に

ロードします。

3. 利き手でピペットを持ちながら、ベンチトップに肘を置き、位置を調整します。ピペットを握っている手をもう一方の手で支え、投与中の制御不能な動きを避けます。

4. マウスが液滴を直接吸い込むことができるように、~2 μLの滴を片方の鼻孔のすぐ近くに置きます(図1Bを参照)。小さな液滴が簡単に形成されない場合は、ピペットチップを新しいものと交換し、操作を繰り返します。ストップウォッチを使用して、接種の間隔を確認します。

5. この装置では、一度に少なくとも 4 匹のマウスを治療できます。別のグループのマウスがステップ2.4を繰り返す必要がある場合は、デバイス上で一度に最大8匹のマウスを収容できるように、最初のバーの上または下に4つの椅子で別のバーを設定します。

6. 最初の接種から3〜4分後に、もう一方の鼻孔でステップ2.4を繰り返します。この時間間隔は、マウスが最初の用量の吸入を完了し、正常な呼吸を回復するのに十分です。マウスの鼻孔から誤って鼻を鳴らしたために吸入した溶液の一滴が取り除かれた場合は、さらに2 μLの溶液を再接種します。

7. 20〜30 μLの投与が終了するまで、交互の鼻孔でプロセス全体を繰り返します。接種手順全体を完了するには~30〜45分かかります。

8. マウスを指定されたケージに戻す前に、マウスの目に湿った軟膏を塗ります。
注: マウスが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。

結果

図1:ポジショニングデバイスを使用したIN接種手順の写真プレゼンテーション。(A) IN接種に必要な実験装置。(B)デバイスに座った頭を下に下げて前かにした位置の動物(左)と、IN接種用の2 μL液滴の沈着(右)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス株
Balb/c Orient	Bio	N/A	6-8週間齢、20-30g
ペプチドRVG9R
	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRRR
ソフトウェア、アルゴリズム、デバイス
マウスポジショニングデバイス	Signet Biotech	N/A
オリゴヌクレオチドおよびプライマー
siSOD1	ST Pharm	N/A	センス: 5'-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
マーST	ファームN	/A	F:5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R:5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'

プライ