細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーターを使用した神経伝達物質放出のイメージング

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス皮質へのCNiFER移植

1. 前にオートクレーブですべての手術器具を滅菌します。70%エタノールで拭き取り、清潔なラボ用おむつを敷いて、手術用の半無菌フィールドを準備します。
2. 垂直電極プーラーのガラスキャピラリー(内径0.53 mm)を引っ張って、CNiFER注入ピペットを準備します。5番の細い先端鉗子のペアを使用して、電極の先端を直径~40 μmに切断します。
   注:これは、経緯線を備えた実体ズーム顕微鏡で行うのが最適です。
3. 成人(生後60〜90日目)C57BL / 6マウスをイソフルランで麻酔する:導入には4%(v / v)、維持には1.5〜2.0%(v / v)。尾またはつま先をつまんで、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。
   注:定期的にピンチし直し、手術中にひげのけいれんを評価して、麻酔の深さを再評価します。
4. 乾燥を防ぐために眼科用軟膏で目を覆います。イヤーバー付きの定位固定フレームにマウスを取り付けます。直腸プローブによって調整されるヒートパッドを使用して、マウスの体温を37°Cに維持します。
5. 動物用電気シェーバーで約5mm×12mmの領域を剃ります。ベタジンを塗布し、続いて 70% (v/v) イソプロパノールを塗布します。メスの刃を使用して、頭蓋骨表面の皮膚を切断して取り除きます。メスの刃を使用して、頭蓋骨の表面から骨膜を取り除きます。定位固定手術で説明されているように、頭蓋骨の表面を露出させて洗浄します。
6. 空のガラスピペットをブレグマに下げ、前後(A / P)および中外側(M / L)座標を記録します。マウス脳アトラスを参照して、注射部位の位置を計算します。ピペットを標的部位に移動し、その後のウィンドウ形成のために頭蓋骨に印を付けます。
   注:注射部位とウィンドウは、研究する領域と、皮質内の神経伝達物質またはペプチド放出突起の分布によって異なります。たとえば、最近の出版物では、定位座標+1.0〜+2.0 mm A / Pおよび+1.0〜+ 2.0 mm M / Lを使用して、CNiFER細胞を前頭皮質に注入し、古典的コンディショニング中のドーパミン放出のin vivoイメージングを行いました。
7. 2 mm x 3 mmの薄くした頭蓋骨窓を形成します。
   注:窓の骨の厚さは15〜20μmである必要があります。骨が十分に薄くなっている場合、頭蓋骨の表面が湿っているときに、骨の小さな白い斑点は見えないはずです。
8. 人工脳脊髄液(ACSF)を浸したスポンジを窓の上に置き、注入する細胞を準備しながら湿らせます。
9. T75フラスコで増殖させたCNiFERクローンを~80%のコンフルエントで収穫します。培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。注:これらのステップではトリプシンは省略されています。
10. PBSを取り除き、10mlのACSFを使用してフラスコの底から細胞を取り除きます。細胞を粉砕して細胞塊を解離させます。ペレットを遠心分離し、100 μlのACSFに再懸濁します。1,400 x g で30秒間遠心分離し、上清を除去し、ACSFで覆われたペレットを残します。このステップにより、細胞の塊が懸濁したままになります。
11. 手順1.2で準備したインジェクションピペットに鉱物油を埋め戻し、ピペットをナノインジェクターにロードし、プランジャーを進めて小さなオイルビーズを排出します。5 μlのCNiFER細胞懸濁液をマウス製剤の近くのプラスチックパラフィンフィルムのストリップに置きます。CNiFERまたはコントロールCNiFERセルを引っ張られたピペットに引き込みます。
12. ピペットをターゲットのX座標とY座標、つまりステップ1.5でメモしたA/PとM/Lに移動します。ピペットを下げて、薄くなった頭蓋骨に穴を開け、頭蓋骨表面から~200〜400μm下まで進み、皮質の2/3層にCNiFER細胞を沈着させます。
13. ナノインジェクターを使用して最も深い部位に~4.6 nlのCNiFER細胞を注入し、オイルと細胞界面の動きを記録してから、細胞が分注されるまで5分間待ちます。ピペットを~100 μm引き出し、さらに~4.6 nlのCNiFERセルを注入し、5分間待ちます。次に、CNiFERの逆流を防ぐために、ピペットをゆっくりと穏やかに引き出します。1つまたは複数の隣接部位で注射を繰り返します。
14. 対照HEK293細胞(すなわち、Gタンパク質共役型受容体[GPCR]を欠くHEK293 / TN-XXL / Gqi5クローン)で注射ステップ1.8〜1.12を繰り返します。CNiFERと制御細胞注射部位を~200 μm分離します。
15. 細胞移植が完了したら、薄くなった頭蓋骨窓をACSFですすぎ、頭蓋骨が乾くのを待ちます。シアノアクリレート接着剤を窓に一滴塗布し(材料を参照)、接着剤の上に事前にカットされた滅菌カバーガラスをすばやく置きます。カバーガラスを頭蓋骨に数秒間そっと押し付けます。接着剤を2分間乾かします。
16. カバーガラスの端を歯科用セメントで密閉し、窓の周りに井戸を形成して、浸漬目的の水を保持します。
17. イメージング中にマウスの頭を固定するには、窓の後ろにシアノアクリレート接着剤を少量垂らした特注のヘッドバーを取り付けます。接着剤を完全に乾かしてから、歯科用セメントを追加して、特注のヘッドバーをさらに補強します。
18. 窓を除く頭蓋骨表面の残りの部分を歯科用セメントの層で覆います。皮膚の端がセメントで覆われていることを確認し、20分間乾燥させます。
19. 手術後、イソフルランの投与を中止し、麻酔から完全に回復するまでケージ内の加熱パッドの上にマウスを放置します。水分補給のために生理食塩水(皮下[s.c.])に5%(w / v)グルコースを注射し、術後鎮痛のために0.05〜0.1 mg / kgブプレノルフィン(腹腔内[ip]、即時放出)を注射します。
    注:ヒトCNiFERに対する潜在的な免疫学的反応を最小限に抑えるために、CNiFERの注射前日から20 μl / 100 gのシクロスポリン(ip)を毎日マウスに注射します。
20. マウスをホームケージに戻して餌と水を飲みます。

2. CNiFERクローンのin vivoイメージング

:ライブイメージングは、2光子顕微鏡と頭部固定装置を使用してマウスで実施されます。イメージングセッション中に麻酔は必要ありません。覚醒状態で動物を撮影する場合は、ストレスレベルを軽減するために、ヘッドレストを一度に数時間に制限してください。動物を家に戻します ケージ 餌と水のイメージングセッションの合間に。潜在的なストレスは、室内の照明とエンクロージャ内のマウスの周囲の部分を暗くすることで最小限に抑えられます。

1. 手術の翌日、頭蓋骨に埋め込まれた金属製のヘッドバーを頭部固定フレームにねじ込んで、マウスをイメージングプラットフォームに取り付けます。
   注:覚醒したマウスをイメージングする場合、ヘッドレスト装置によって誘発される潜在的なストレスのため、イメージングセッションは数時間を超えてはなりません。
2. 頭を拘束したマウスを備えたイメージングプラットフォームを、10X(0.30 NA)および40X(0.80 NA)の水浸対物レンズを備えた2光子イメージング顕微鏡に配置します。
蛍
3. 光共鳴エネルギー移動(FRET)イメージング用のフィルターキューブ(強化シアン蛍光タンパク質[eCFP]およびシトリン)は、505 nmのダイクロイックミラーと、eCFP測定用の460 nm〜500 nm、シトリン測定用の520 nm〜560 nmのバンドパスフィルターを備えています。
薄
4. くされた頭蓋骨の窓を含むウェルにACSFを追加し、水浸対物レンズをACSFに下げます。接眼レンズを水銀ランプおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターキューブと組み合わせて使用して、窓の下の皮質と血管系の表面を見つけます。
   注:血管系のパターンは、何日も繰り返すイメージングで同じ領域を見つけて画像化するのに役立ちます。 40倍水浸対物レンズに切り替えて、GFPフィルターキューブと水銀ランプを使用して細胞上の皮質の表面に手動で焦点を合わせることで、CNiFERを特定します。
5. 2 光子イメージング用にセットアップします。2光子イメージングに適した光路を選択します。一般的な商用システムでは、ソフトウェアを使用して2光子イメージングモードに切り替え、デスキャンされていない検出器の光電子増倍管(PMT)に光をリダイレクトします。近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにし、820 nmの波長と5〜15%の出力設定を選択します。
   注:通常、5%の電力は試料で~25 mWを提供します。
6. PMT1 & PMT2電圧を最大値(PMTに応じて通常700〜1,000 V)に近づけます。各チャネルのゲインを1に設定し、対物レンズのz位置をゼロ
にします。
7. 対物レンズを皮質表面から~100〜200 μm下げ、x-yスキャンを開始します。各チャネル(eCFPとシトリン)のレーザー出力、ゲイン、PMT電圧を調整して、CNiFER蛍光の信号対雑音比を最適化します。
8. ソフトウェアのズーム機能を使用して、画像をCNiFERセルと背景領域を含む領域に制限します。スキャンレートは、ピクセルあたり 4 μs で 2 秒ごとに 1 フレーム (0.5 Hz) 以上遅くありません。適切な信号対雑音比(カルマン2ライン平均化など)にライン平均化を調整します。
9. CNiFERセルの周囲に関心領域(ROI)を描画し、平面ごとに約3〜4個のセルを囲みます。ROI平均強度のリアルタイム分析を設定します。取得を開始して、CNiFER蛍光を経時的に監視します。
10. ユーザーが決定したように、電気刺激、チャネルロドプシン-2 (ChR2) 刺激、挙動などの実験操作の前および最中に CNiFER から蛍光を収集します。
11. イメージング実験が完了したら、マウスをホームケージに戻します。必要に応じて、数日にわたってイメージングを繰り返します。再イメージングする場合、細胞は以前に取得した低倍率血管系画像を参照して、同じイメージングフィールドに戻します(ステップ2.4)。
    注:移植されたCNiFERは、少なくとも7日間イメージングできます。