組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の単離と精製

要約

出典: Jain, RW, et al.実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質の簡単で効率的な生産と精製J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)研究で使用される組換えミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG)であるMOGtagの単離と精製を示します。このプロトコルには、精製されたMOGtagを得るための細菌溶解、超音波処理、遠心分離、およびニッケルアフィニティークロマトグラフィーが含まれます。このタンパク質は、多発性硬化症モデルにおけるB細胞を介した自己免疫研究を可能にします。

プロトコル

1。MOGtagタンパク質の採取

注

:この段階で、細菌は大量のMOGtagタンパク質を産生します。MOGtagを採取するために、最初に細菌をTriton X-100バッファーで溶解し、続いて超音波処理を行います。次に、MOGtag は封入体から放出され、イミダゾールとグアニジンで変性し、MOGtag タンパク質を含む粗タンパク質溶液が得られます。

1. 一晩培養物の1つから1mlのアリコートを1つ取り、1.5mlの微量遠心チューブに移します。細胞を16,000 x g で1分間ペレット化し、上清を除去します。チューブにTO/N(誘導後)をラベル付けし、細菌ペレットを-20°Cの冷凍庫に入れて、将来のSDSページ分析を行います(図2)。
2. 高速遠心分離に対応した250mlボトルに培養物を均等に分散させ、この時点から氷上に保管します。細菌細胞を22,000 x g で4°Cで15分間ペレット化します。
3. 上清を捨てます。細菌ペレットを-20°Cで保存するか、ステップ1.4に進みます。
4. 60 μlのTriton X-100および120 μlの50 mg / ml鶏卵リゾチームストック溶液を60 mLのPBSに加えることにより、溶解バッファー(0.1 mg / ml鶏卵リゾチーム、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の0.1%Triton-X(v / v))を調製します。
5. ステップ1.3のすべての細菌ペレットを再懸濁し、合計30mlの溶解バッファーに結合します。この容量を高速遠心分離可能な丸底の50mlチューブに移します。このチューブを30°Cの水浴に30分間入れます。インキュベーション期間中、チューブを2回振って細胞を再懸濁します。
6. インキュベーション後、チューブを氷上に移し、20 kHz、振幅70%、パルスオン、パルスオフ3秒、およびラウンドあたり5パルスで溶液を超音波処理します。合計6ラウンドにわたって溶液を超音波処理し、ラウンドの合間に溶液を氷上で冷却します。
7. 溶液を24,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。上清を廃棄し、手順1.5〜1.7を1回繰り返します。ペレットを-20°Cで保存するか、ステップ1.8に進みます。
8. 0.8766 gのNaCl、0.09456 gのTris-HCl、および0.01021 gのイミダゾールを100 mlビーカーに加えることにより、バッファーA(500 mM NaCl(塩化ナトリウム)、20 mM Tris-HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩)、5 mMイミダゾール、pH 7.9)を調製します。容量が28mlに達するまで水を加え、溶液のpHを7.9に調整します。次に、溶液を100mlメスシリンダーに移し、容量が30mlになるまで水を加えます。
9. ステップ1.7のペレットを30mlのバッファーAに再懸濁し、この溶液を4°Cで3時間インキュベートします。この間に、17.2 gのグアニジン-HClを計量します。
10. ステップ1.6と同じ設定を使用して、氷上で溶液を超音波処理します。次に、17.2 gのグアニジン-HClを溶液に加えます。これを氷上で1時間インキュベートして、MOGtagタンパク質を可溶化します。
11. 溶液を24,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。上清を回収し、タンパク質精製まで上清を4°Cで保存します。

2.タンパク質精製

注:次のステップでは、MOGtagタンパク質は、荷電ニッケル樹脂への4ラウンドの吸収(Hisタグを介して)および溶出によって精製されます。

1. 次のバッファーを作成します:
   1. バッファーB(500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mMイミダゾール、6 Mグアニジン-HCl、pH 7.9)を調製します。5.844 gのNaCl、0.6304 gのTris-HCl、0.0681 gのイミダゾール、および114.64 gのグアニジン-HClを500 mlのビーカーに加えます。次に、190mlに達するまで水を加え、pHを7.9に調整します。溶液を250mlメスシリンダーに移し、容量が200mlになるまで水を加えます。
   2. 溶出バッファー(500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、0.5 M イミダゾール、6 M グアニジン-HCl、pH 7.9)を調製します。500 mLビーカーに5.844 gのNaCl、0.6304 gのTris-HCl、6.808 gのイミダゾール、および114.64 gのグアニジン-HClを加えます。190mlになるまで水を加え、pHを7.9に調整します。溶液を250mlメスシリンダーに移し、容量が200mlになるまで水を加えます。
   3. ストリップバッファー(500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、100 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、pH 7.9)を調製します。5.844 gのNaCl、0.6304 gのTris-HCl、40 ml 500 mM EDTAを500 mLビーカーに加えます。190 mLに達するまで水を加え、pHを7.9に調整します。溶液を250mlメスシリンダーに移し、容量が200mlになるまで水を加えます。
   4. チャージバッファー(0.1 M硫酸ニッケル)を調製します。5.257 mlのビーカーに500 gの硫酸ニッケルを加え、190 mlに達するまで水を加えます(注意、硫酸ニッケルが水に溶けるまで、ヒュームフードの外で硫酸ニッケルを扱わないでください)。硫酸ニッケルが溶解したら、溶液を 250 ml メスシリンダーに移し、容量が 200 ml に達するまで水を加えます。
2. 4,500 x g を超える遠心力に耐えることができる 2 本の円錐形の 50 ml 遠心分離管に 10 ml のニッケル樹脂を分割します (各チューブに 5 ml)。
3. ニッケル樹脂を装入して平衡化します:
   1. 樹脂が入っている各チューブに40mlの水を加えて樹脂を洗浄します。チューブをロッカーの上に水平に置き、4°Cで5分間撹拌します。終了したら、チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。
   2. ペレットを乱さないようにピペッティングして上清を廃棄します。各チューブに40mlのチャージバッファーを加えます。チューブをロッカーに移し、4°Cで15分間撹拌します。終了したら、チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。
   3. 上清を廃棄し、40mlのバッファーBをチューブに加えます。チューブをロッカーに移し、4°Cで5分間撹拌します。終了したら、チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離し、上清を廃棄します。
4. オプション:ステップ1.11で収集した可溶化タンパク質150 μlを取り、1.5 mlの微量遠心チューブに移します。チューブにプレインキュベーションとしてラベルを付け、将来のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)ページ分析のためにこれを-20°Cで凍結します(図2、粗MOGtag)。
5. MOGtagタンパク質を精製します:
   1. ステップ1.11(~40 ml、ステップ2.4で除去した小さなサンプルを差し引いた)から、ステップ2.3のニッケル樹脂を含む最初のチューブ(図1、チューブ1)に可溶化タンパク質の全量を移し、混合し、4°Cのロッカーに水平に1時間置きます。
   2. チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。完了したら、上清をニッケル樹脂の2番目のチューブ(図1、チューブ2)に移し、前のステップで説明したようにインキュベートします。その間に、チューブ1で以下の手順3〜6を続行します。
   3. ニッケル樹脂をチューブ1に溶出バッファー40mlに再懸濁し、チューブを4°Cのロッカーに水平に5分間置きます。次に、チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。
   4. 溶出したMOGtagタンパク質を含む上清を「精製MOGtagタンパク質」とラベル付けされた250mlボトルに移し、このボトルを4°Cに保ちます。溶出ステップごとに、得られた上清をこのボトルにプールします。
   5. ニッケル樹脂に40mlのストリップバッファーを加え、ロッカーの上に水平に4°Cで5分間置きます。
   6. チューブを4,500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。上清を廃棄し、ステップ2.3にリストされているようにニッケル樹脂を再充填します。
   7. 完了したら、手順2.5にリストされているように、2番目のチューブを進みます。ステップ1.11から荷電したニッケル樹脂への可溶化タンパク質の合計4ラウンドの吸収と溶出により、タンパク質の大部分が回収されますが、必要に応じて、追加の吸収および溶出ラウンドで追加のタンパク質を回収できます。
6. 4回(またはそれ以上)の吸収と溶出が完了したら、プールした精製タンパク質を4°Cで一晩保存します。ニッケル樹脂は、40 mlの20%エタノール溶液で4°Cで、再び必要になるまで保存できます。

結果

図1:純粋なMOGtagタンパク質を生産するために必要な手順の概要。 MOGtagタンパク質を生成するために、MOGtagタンパク質を発現する細菌を高密度に増殖させ、セクション1にリストされているようにIPTGを使用してMOGtagを発現するように誘導します。一晩培養した後、細菌を溶解し、一連のペレット化ステップを通じて、セクション1にリストされているように、MOGtagを含む封入体を含むタンパク質画分が抽出されます。次に、MOGtagは、セクシ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BL21 大腸菌- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		細菌は、MOGtagタンパク質を作るために必要です。これらの細菌のグリセロールストックは、ご要望に応じて入手可能です。
LB ブロス製粉機	Bioshop	LBL407.1
アンピシリン	バイオ ベーシック	AB0028	粉末を 100 mg/ml で 50% エタノール/50% H₂O に再溶解します。-20 °C で保管します。
IPTG	Bioshop	IPT002.5	を1MでH₂Oに再溶解し、-20°Cで保存します。
鶏卵リゾチーム	Bioshop	LYS702.10	H₂O中で50 mg/mlで再構成し、-80°Cで保存します。
Triton-X100	Sigma	T-8532
リン酸緩衝生理食塩水	Life technologies	20012-027	市販のリン酸緩衝生理食塩水は必要なく、標準的な実験室製のリン酸緩衝生理食塩水で十分です。
塩化ナトリウム	バイオショップ	SOD004.1
トリス-HCl	バイオショップ	TRS002.1
イミダゾール	バイオショップ	IMD508.100
グアニジン-HCl	シグマ	G3272	品質は純度 98% 以上でなければなりません。
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
硫酸ニッケル (II)	Bioshop	NIC700.500
His 結合樹脂	EMD Millipore	69670-3	20% エタノール 80% H₂O で 4 °C で保存
水エタノール	市販のアルコール	P016EAAN	必要に応じて水で希釈します。
氷酢酸	Bioshop	ACE222.1
酢酸ナトリウム三水和物	Bioshop	SAA305.500
ウシ血清アルブミン標準	bio-rad	500-0206
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物	フィッシャーサイエンティフィ	BP120-500
ポリエチレングリコール 3350	バイオショップ	PEG335.1
ポリエチレングリコール 8000	Bioshop	PEG800.1
超音波処理器	フィッシャー科学	FB-120-110
ドデシル硫酸ナトリウム	Bioshop	SDS001

これらの粉末は、無ック