逆行性ニューロントレースのためのラット脊髄へのウイルスベクター注射

要約

出典: Keefe, K. M., et al.レンチウイルスベクターの直接注射はラット脊髄の複数の運動経路を浮き彫りにするJ. Vis. 経験。(2019)。

このビデオでは、ラット脊髄に高効率の逆行性輸送(HiRet)ウイルスベクターを注入して、ニューロン経路を追跡する方法を示します。このウイルスには、シナプス侵入用の糖タンパク質と蛍光タンパク質コード遺伝子があります。針を脊髄に挿入し、ウイルス懸濁液を制御された速度で投与します。ウイルスの拡散に十分な時間を確保した後、針は最終的に引き抜

かれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 術前の準備:

1. ナノリットルのインジェクター用に設計された 3.5 ナノリットルのガラス キャピラリー ピペットを使用して、手術の数日前にウイルス注射用のプルガラス針を準備します。製造元の指示に従って、各ピペットを 2 段階のニードル プラーで引っ張り、2 針テンプレートを作成します。
2. マイクロハサミで約1〜2 mmの余分なガラスを切り取って、針テンプレートの先端を洗練します。顕微鏡キャリブレーションスライドを使用して顕微鏡下でおおよその開口部サイズを測定し、30〜40μmの開口部の針を分離します。
3. 針を30°に配置した状態で、マイクロピペット面取り機を使用して、30〜40μmの開口部と45°の面取り角度を持つチップを作成します。キャリブレーションスライドのバーニアスケールを使用して、開口幅を確認します。柔軟な針アタッチメント付きの注射器を使用してガラス針に水とエタノールを通し、破片を洗い流し、黒いマーカーで一定の間隔で針に印を付けます。
針
4. を70%エタノールで洗浄した蓋付きのペトリ皿に入れ、紫外線または紫外線の下でバイオセーフティフードで30分間滅菌します。
5. 手順の直前に冷凍庫から適切な量を取り出すことにより、高効率逆行性輸送(HiRet)レンチウイルスを調製します。
   注:適切な容量には、注入に必要な量(注射あたり1 μL×注射回数)と、ピペッティングとローディングの損失を考慮した少量の追加容量が含まれます。使用しないときは、ウイルスを氷の上に輸送して保管してください。
6. インジェクターをマイクロポンプに差し込み、バーニアスケール付きのマイクロマニピュレーターに配置して準備します。
7. ガラス針を準備するには、柔軟な針を備えた注射器で赤い油などの色付きの染料を慎重にロードします。針に気泡が残らないようにしてください。針を取り扱うときは無菌技術を使用し、先端に触れないようにしてください。
8. ガラス針をインジェクターに挿入し、針がワッシャーに正しく装着され、インジェクターキャップがしっかりとねじ込まれ、スチール製インジェクター針がガラス針の長さの約3/4に伸びていることを確認します。ウイルスは後のステップで針にロードできます。

2. 麻酔と手術部位の準備

1. デジタル体重計で動物の体重を量ります。術前の体重を記録して、必要な麻酔薬の量を決定し、手術後の体重を監視できるようにします。このプロトコルでは、約200〜250 gの雌スプレイグ・ドーリーラットを使用しました。
2. イソフルラン吸入または注射されたケタミン/キシラジン溶液(k / x)のいずれかを使用してラットを麻酔します。ここでは、ケタミンを 67 mg/kg で腹腔内注射し、キシラジンを 6.7 mg/kg の用量で
注射します。
3. 足をしっかりとつまんで適切な麻酔面を確認します。反射的離脱が発生した場合は、続行する前にさらに数分待ってください。
   注:また、ひげ、目、呼吸数を観察して、意識の兆候がないか確認してください。ひげがけいれんしたり、軽く触れたときに目がまばたきしたり、呼吸が速くて浅い場合は、麻酔面が深くなるまで待ってプロトコルを続行します。また、椎弓切除術および注射手術全体を通してこれらの兆候を監視してください。動物が浅い麻酔面を示す場合は、元のk / x投与量の1/2に等しいケタミンのみのブースターショットを投与します。
4. 腰から肩甲骨の下角までの背側正中線に沿ってラットを剃ります。動物の皮膚をぴんと張って引っ張ると、より簡単かつ正確に剃ることができます。
5. 両目に眼科用軟膏を塗ります。
6. 剃った部分に消毒剤を塗布して、その部位を滅菌します。最初のスクラブでは、滅菌ガーゼを5%ヨウ素溶液に浸し、髪の毛や破片をすべて拭き取ります。これに続いて、70%エタノールに浸した滅菌ガーゼで一方向にスワイプし、領域に2回接触しないようにします。これと同じ手法をヨウ素とエタノールに浸したガーゼを交互に2回使用します。

3. 手術野と器具の準備

メ

1. ス、ロンジャー、ラット歯鉗子、ばねはさみ、止血剤、中点湾曲鉗子、リトラクターまたは加重フックを含むオートクレーブ手術器具のセットを準備し、滅菌ラップを開封して無菌野を作成します。
2. 滅菌手術用手袋のパッケージを開き、滅菌手袋ラップをテーブルの上に置きます。これを、滅菌ラップの汚染を防ぐために、使用済みツールの追加滅菌フィールドとして使用してください。
3. #10メスの刃を無菌フィールドに落とします。止血剤でブレードをハンドルに固定します。滅菌生理食塩水、4.0クロムキャットガット縫合糸、および焼灼器、滅菌ガーゼ、滅菌綿先アプリケーター(筋肉出血用)、ゲルフォームまたはボネワックス(骨出血用)などの出血を制御する材料を手の届いた場所に配置します。
4. 動物を回収し、滅菌布の上に置きます。膀胱の下にガーゼを置き、尿を集めます。腹部の下に丸めたタオルでターゲット領域を支えます。可能であれば、特に長時間の処置の場合は、滅菌布の下に外科用加熱パッドを置きます。
   注:生存手術中は無菌性が重要です。手袋をはめた手の無菌性を維持するために70%エタノールのスプレーボトルを手元に置いておくと、器具の無菌性が損なわれる場合、または個々の手術の合間にビーズ滅菌器を使用してください。

4. 脊柱を露出させ、椎弓切除部位を特定する

1. 最後の肋骨を指で軽く押して、腰椎または L1 椎骨の位置を特定し、皮膚切開を行う領域を特定します。これを目印として、L1のすぐ下の終わりの#10手術用メスで3〜4cmの皮膚切開を行い、筋肉を露出させます。メスの刃でやさしく広げてしっかりと押して、皮膚をぴんと張って、きれいに切開します。
2. 必要に応じて、鉗子とハサミで表層脂肪を切って広げます。(対象椎骨によっては、筋肉の表面に大きな脂肪パッドがある場合とない場合があります。
3. メスの刃の平らまたは指で棘突起を感じます。多くの場合、正中線領域は、両側に白い筋膜の「V」で輪郭が描かれます。ネズミの歯鉗子で上部の突起にしっかりとつかむスペースを確保するために吻側に小さな切り込みを入れ、次に、できるだけ突起に近づけて長くて深い切り込みを2回行います。切り傷の最も深いところでは、椎骨の背側表面がメスの刃で感じられます。
視
4. 認性を高めるために、リトラクターまたは加重フックで外側の筋肉を脇に保持します。メス、バネハサミ、またはロンガーで突起の周りの筋肉をきれいにして、頭の形を決定します。
   注:脊髄組織は骨よりも発達の早い段階で成長を停止するため、脊髄は脊柱の全長を伸ばさないことに注意してください。これは、ターゲットの脊椎レベルが別の名前の椎骨の下にある可能性があることを意味します。
5. 胸部またはT11および隣接するT12およびT13突起を見つけます。
   注:正しい椎骨レベルを標的とするための支援は、ラット脊髄アトラスおよび非常に類似した椎骨構造を有するマウスのランドマークを概説する以前の研究に見られます6,33。T9などの吻側棘突起を邪魔せずに残して、正中線のランドマークを与えます。

5.椎弓切除術の実施

1. 標的領域が正しく特定されたら、T11-T13の背側の椎弓切除術を行います。椎骨をそっと広げて椎間靭帯を露出させ、椎間靭帯は骨の最初の噛みつきのためにロンガーを挿入するのに良い部位です。ロンジュールを半閉じた位置に保持して、細かいコントロールを高めます。
2. ロンジャーで小さな噛みつきをとることによって、棘突起と椎骨の背側を取り除きます。脊髄を傷つけたり、硬膜を乱したりしないように注意してください。ラットの歯鉗子で少し持ち上げると、脊髄が椎骨から引き離され、脊髄組織に当たる傾向が減ります。
3. 正中線の血管を観察できるように、正中線から骨を取り除きます。脊髄組織がはっきりと見え、破片のない窓を残してください。
4. 鉗子で脊髄にそっと触れます。一部の動物は、麻酔面が深くても反射的にジャンプすることがあります。注射中のジャンプを防ぐために、リドカインなどの麻酔剤を脊髄に直接数滴塗布します。
安定
5. 鉗子を棘突起、吻側および尾側に椎弓切除窓に固定することにより、動物を脊椎ホルダーに固定します。脊椎ホルダーを使用して動物の腹部を持ち上げ、呼吸運動の影響を打ち消します。これにより、針の安定性が向上し、適切な注入深さが確保されます。

6. ウイルスのロードとインジェクターの位置決め

パラ

1. フィルムに約 5 μL をピペッティングし、先端がドロップの内側になるように針を配置して、ウイルスをインジェクターにロードします。
2. マイクロポンプを使用して、20〜100 nL/sの速度で最大4 μLのウイルスを回収します。
針の
3. 先端が詰まらないように、針から少量のウイルスを注入および放出するようにコントローラーを設定します。実験室用ワイプで余分なウイルスを拭き取ります。
   注:スチール針付きのハミルトンシリンジは、プルガラスピペットの代わりに使用できます。
4. バーニアスケールが見えるようにマイクロマニピュレーターを配置し、脊髄の正中線に針を配置します。
   注:正中線は、脊髄の前面を走る大きな血管によって位置づけられることがあります。ただし、これは個々のラットで異なる可能性があり、正中線のターゲティングは、無傷の棘突起と比較することによって確認する必要があります。
5. マイクロマニピュレーターのバーニアスケールを使用して、針を横方向に0.8mm向けます。
6. 硬膜に穴を開けるのではなく、へこまむまで針を脊髄まで下げます。素早くひねる動作を使用して、硬膜が1.5mmの深さまで沈むまで針で硬膜に穴を開

けます。

7. 脊髄へのウイルスの注入

1. 針が所定の位置に配置されたら、400 nL/分の速度で注入するようにインジェクターをプログラムします。色素フロントの進行を観察して、ウイルスが脊髄に侵入していることを確認します。脊髄組織の明らかな漏れや膨らみがあってはなりません。漏れが観察された場合は、射出速度を200 nL/minに下げることでこれを軽減できる場合があります。
2. 注射が終了したら、ウイルスの拡散を促進するために、針を脊髄内で2〜5分間(注射量に応じて)置いてください。
3. ゆっくりと針を抜き、次の注射部位に移動します。L1-L4脊髄組織の長さに沿って約1 mm間隔で等間隔で配置された6つの部位のそれぞれに1 μLのウイルスを注入します。適切に機能し続ける限り、各注射に同じ針を使用できます。

8.創傷閉鎖と術後のケア

1. 脊椎ホルダーから動物を取り外し、外側の筋肉を広げるために使用するレトラクターまたはフックを取り出します。閉じる前に、傷口にすべての破片がないことを確認してください。
2. 4.0クロムキャットガット縫合糸を使用して筋肉を縫合します。内部の皮膚刺激の可能性を減らすために、結び目の近くで縫合糸を切断します。
3. 9 mmの巻いたクリップを使用して、皮膚をステープルで留めます。最適な治癒を可能にするために、ホチキス止めする前に皮膚の端を並
べます。
4. 動物を水対流加温パッドの上に置き、目覚めるまで監視します。
5. 5〜10 mLの滅菌生理食塩水を皮下注射して水分を補給し、感染を防ぐためにセファゾリンなどの抗生物質を補充します。動物が歩行可能になったら、ホームケージに戻し、最初の鎮痛剤を与えます。ラットに痛みや苦痛の兆候がないか監視し、施設の動物管理および使用委員会(IACUC)が承認した痛みを軽減するための手順に従って治療します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#10 メスの刃	Roboz	RS-9801-10	メスで使用します。
1 mL シリンジ	Becton, Dickinson and Company	309659	酔薬 IP 注射、潜在的な麻酔薬ブースター ショット、および抗生物質注射用。
10mLシリンジ	Becton, Dickinson and Company	309604	手術後に動物に生理食塩水を注入するため。
4.0 クロミック Catgut 縫合糸	DemeTECH	NN374-16	閉鎖時に筋肉を再結合します。
48000 マイクロピペット ベベラー	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	32416	引っ張られたガラス毛細管の先端を面取りして機能的なガラス針を形成するために使用されます。
5% ヨウ素溶液	Purdue Products LP	L01020-08	手術部位の滅菌に使用します。
70%エタノール	N/A	N/A	しく準備されたガラス針、手術準備中の動物モデル、手術中の外科医の手の滅菌、およびその他すべての軽微な無菌性の維持に。
麻酔薬(ケタミン/キシラジン溶液)	ゾエティス	240048	手術中に動物を正しい意識面に保つため。
抗生物質 (セファゾリン)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	手術後の感染を防ぐために皮下注射します。
ビーズ滅菌器	CellPoint	5-1450	手術器具を加熱滅菌します。
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	骨出血の場合に骨を密閉します。
焼灼器	ファインサイエンスツール	18010-00	手術中に切断された動脈や静脈を密閉し、過剰な失血を防ぎます。
デジタルスケール	Okaus	REV.005	外科的準備中に動物の体重を測定します。
フレキシブル針アタッチメント	精密機器	MF34G-5	針の洗浄とガラス針への赤い油の装填用。
ゲルフォーム	ザーH68079	出血の場合に骨を密閉します。
ガラス毛細管世界	精密機器	4878	っ張られたガラス針用 - ナノリットルのインジェクター用に設計されるべきである。
バリカン	Oster	111038-060-000	手術部位の毛髪を取り除くため。
止血剤	Roboz	RS-7231	手術における一般的な使用用。
キムワイプ	キムテック	34155	手術における一般的な使用。
ミディアムポイントカーブ鉗子	Roboz	RS-5136	手術での一般的な使用用。
バーニアスケール付きマイクロマニピュレーター	Kanetec	N/A	手術中の正確なターゲティング用。
マイクロハサミ	Roboz	RS-5621	抜いたばかりのガラス毛細管からガラスを切るため。
ライトおよびバーニアスケールの顕微鏡	眼科 Leitz Wetzlar	N/A	っ張られたガラス毛細管の機能的なガラス針への面取りを視覚化および測定するために使用されます。
マイクロシリンジポンプコントローラー	World Precision Instruments	62403	注入速度を制御します。
ナノリットル 2000 ポンプ ヘッド インジェクター	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	500150	制御された方法でウイルスをロードして注入します。
ニードルプーラー	ナリシゲ	PC-100	ガラス毛細管を加熱して引き離し、ガラス針を形成します。
眼科軟膏	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	手術中に動物の目を保護するため。
パラフィルム	Bemis	PM-996	ナノインジェクターへのウイルスのロードを補助します。
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	1mLおよび10mLシリンジで使用し、動物モデルの注射を可能にします。
ラット歯鉗子	Roboz	RS-5152	棘突起を把持するため。
レッドオイル	N/A	N/A	注射中に組織に侵入するウイルスを視覚化するためのフロントを提供します。
レトラクター	Roboz	RS-6510	手術創を開いたままにします。
リマジル錠	Bio Serv	MP275-050	術後の疼痛管理用。
Rongeurs	Roboz	RS-8300	手術中に脊柱から筋肉を除去します。
メスの刃のハンドル	Roboz	RS-9843	手術中に動物モデルの皮膚と脂肪パッドをスライスします。
はさみ	ロボズ	RS-5980	手術での一般的な使用に適しています。
ステンレススチール創傷クリップ	CellPoint	201-1000	閉鎖時に手術創の皮膚を結合します。
ステープル除去鉗子	Kent Scientific	INS750347	ステープルを外すには、ステープルが正しく適用されていない場合。
滅菌布	ニックス研究製品	BP-989	のための無菌表面を提供する。
滅菌綿先端アプリケーター	Puritan	806-WC	無菌性を維持しながら、手術創の血液を吸収します。
滅菌ガーゼ	Covidien	2146	無菌性を維持しながら手術部位や手術器具を洗浄します。
滅菌生理食塩水	クスターヘルスケアコーポレーション	281324	血液の浄化、および手術後の体液の補充に使用します。
手術用手袋	N/A	N/A	外科医が手術中に無菌野を維持するために使用します。
外科用加熱パッド	N/A	N/A	手術中の動物モデルの体温を維持するため。
手術用顕微鏡	N/A	N/A	手術創の視覚化を強化します。
外科用ステープラー	ケント サイエンティフィック	INS750546	ステープルを貼り付けます。
T/ポンプ温熱療法ウォーターポンプ	Gaymar	TP500C	流加温パッドに温水を汲み上げます。
水対流加温パッド	バクスターヘルスケア株式会社	L1K018	不明の動物の体温を維持するための術後の回復エリアで使用します。
加重フック	N/A	N/	A 手術創を開いたままにします。

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