糖尿病ラットモデルにおける神経活動電位を遮断するための高密度集束超音波

要約

出典: Lee, Y. F., et al.糖尿病ラットモデルにおける神経伝導ブロックのための超音波ツールJ. Vis. 経験。(2017年)

このビデオは、糖尿病ラットモデルで坐骨神経から腓腹筋までの活動電位をブロックするための高密度集束超音波 (HIFU) の使用を示しています。HIFU ビームを神経に照射すると、筋肉信号が減少することで、糖尿病性神経因性疼痛緩和のための非侵襲的治療法としての HIFU の可能性が確認されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 高密度集束超音波(HIFU)トランスデューサーによるin vivo神経伝導遮断

注

:in vivo実験は、50 mg / kgストレプトゾトシン(STZ)注射後5週目に開始されます。

1. HIFU超音波処理で複合筋活動電位(CMAP)をブロックする前に、動物の手順を実行します。
   1. 手術前に手術器具(メス、ハサミ、鉗子、ガラスフック)をオートクレーブで滅菌します。
   2. チレタミン/ゾラゼパム混合物(40 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の腹腔内注射、またはイソフルラン気化器を介して1.75%のイソフルランを吸入してラットを麻酔します。体温を維持するためにネズミを加熱パッドの上に置きます。
   3. 手術用のラットを腹側臥位に配置します。眼軟膏を塗ります。ラットの脚を伸ばし、足の足底面を爪でつまんで麻酔の深さを確認します。ラットが離脱反応を示す場合は、追加の麻酔を適用します。
   4. 電動バリカンでラットの太ももと腰の毛を取り除きます。手術部位に清潔なガーゼで液体ヨウ素を塗布し、ガーゼを手術部位から外側に円を描くように動かします。アルコールパッドを使用して、同じ円を描くように液体ヨウ素を拭きます。この実験は、左右の手術部位で行われます。手順の次のステップを実行するときは、他の手術部位で手順を繰り返します。
   5. 滅菌手術用ハサミまたはメスを使用して、太ももの背側の皮膚を切開します。鈍い手術用ハサミを使用して、皮膚の下の組織を慎重に分離し、皮膚フックで皮膚を固定します。大腿骨は筋肉の中に見ることができます。
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   6. さみを使用して、筋肉に埋め込まれている太ももの中央坐骨神経線維が見えるまで、大腿骨と平行な筋肉を慎重に分離します。ガラスフックを慎重に使用して、太ももの中央坐骨神経を周囲の結合組織や筋肉から分離します。
2. カスタムメイドの神経固定器を使用して、坐骨神経をHIFU焦点ゾーンに配置します(図1および図2)。
   注:カスタムメイドの神経固定器は3つのコンポーネントで構成されています(図2)。すべてのコンポーネントは透明なポリメタクリレートメチル(PMMA)でできています。コンポーネントIの上部構造の雄ねじは高さ2.5mmで、M10XP0.7です(図3A)。中央の井戸は、コンポーネントIを通る直径4.0mmの穴です。井戸の底の開口部はテープで密閉されています。スロットの直径は 1.2 mm で、スロットの中心面とコンポーネント I の上面との間の距離は 3.1 mm です。コンポーネントIIは、本体、4本の脚、および底部構造で構成されています(図3B)。底部構造のめねじは高さ2.5mmで、コンポーネントIのおねじにフィットするようにM10XP0.7です。中央の穴の直径は、コンポーネントIの中央井戸と同じです。本体の寸法は直径32mm、厚さ5.4mmです。4本の脚が左右対称に展開されています。2 つの同一の短い脚は位置合わせ用に設計されており、2 つの同一の長い脚はコンポーネント III に引っ掛けるために機能します。コンポーネントIIIの外径と高さは41mmと9.2mmです。めねじはM36XP1.0で、貫通穴の直径は27.5mmです(図3C)。コーンは、上部の開口部が直径 84 mm、下部の開口部が直径 27.5 mm の中空テーパーです。高さは57.5mmです(図4A)。
   1. 実験前に、特注のアクリル神経固定器を漂白剤溶液に30〜60分間浸した後、滅菌水に浸します。
   2. ガラスフックを使用して、神経を慎重に持ち上げ、コンポーネントIのスロットに入れます。
   3. コンポーネントIIをコンポーネントIにねじ込みます。コンポーネントIの中央ウェルに、超音波伝播と神経保存のためのリンゲル溶液で満たします。
   4. コンポーネントIIIをHIFUハウジングコーンにねじ込みます。コンポーネントIIIをコンポーネントIIの4本の脚を通してコンポーネントIIとドッキングします。
      注:3つのコンポーネントとトランスデューサの幾何学的中心が整列しています。神経とトランスデューサーの間の距離は焦点距離に等しく、神経がHIFU焦点ゾーン内にあることを保証します。
3. 1対の鍼を坐骨神経の起点に挿入し、もう1対を腓腹筋に挿入します。各針のペアを電気同軸ケーブルを介して電気生理学取得システムに接続します(図1)。
   注:ケーブルの一方の端には、2本の針を別々にクリップするための2つのワニ口クリップがあり、ケーブルのもう一方の端には、システムをリンクするためのバヨネットNeill-Concelman(BNC)コネクタがあります。鍼のペアは、坐骨神経の刺激電極として、腓腹筋の記録電極として機能します。
   1. 電気生理学取得システムのサンプリングレートと帯域幅をそれぞれ50 kHzと70 Hz-3 kHzに設定します。坐骨神経の起点にある刺激電極に、パルス幅0.1ミリ秒の超最大刺激を加えます。
   2. 記録電極からのCMAPを記録し、電気生理学取得システムの内蔵アンプでCMAPを増幅します。
      注:電気生理学取得システムの内蔵アンプを使用して神経信号を増幅し、電気生理学取得システムで記録電極からのCMAPを記録します。
4. 市販の2.68 MHz HIFUトランスデューサを使用して、糖尿病性神経障害ラットのCMAPを抑制します。
   注:トランスデューサの仕様は、開口部直径6 cm、焦点距離5 cm、自由視野の深さ4 mm、幅0.8 mmの楕円体焦点ゾーンを有する単一要素球状ボウルとして説明されています。
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   1. 気水で満たされたタンクに球形のコーン、HIFUトランスデューサー、およびコーンカバーを浸します。HIFUトランスデューサーを球形円錐に入れ、6本の頭のネジで円錐形の上部開口部に円錐カバーを固定します(図4B)。水に比べて気泡の密度が低いため、球形円錐内の気泡が自然に排出された後、円錐の前端の開口部を厚さ0.03mmの透明テープで密閉します。コンポーネントIIIを球形円錐にねじ込みます。
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   2. 気した水タンクから球形の円錐とコンポーネントIIIを備えたHIFUトランスデューサーを取り出します。
      注:研究で使用された逆浸透(RO)水は、逆浸透のプロセスによって浄化された水です。RO水を沸騰させてガスを排出します。冷却後、脱気水は個々の密閉タンクで得られます。
5. コンポーネントIを神経と筋肉の間の空間に慎重に入れ、コンポーネントIの隙間に神経を配置します。手順1.2.3および1.2.4を実行して、神経がHIFUの焦点ゾーン内にあることを確認します(図2A)。
6. ファンクションジェネレータと高周波パワーアンプをリンクします。パワーアンプをHIFUトランスデューサーに接続して、HIFUビームを生成します。パワーアンプを介してファンクションジェネレータのHIFUトランスデューサへの電圧出力を手動で設定します。HIFU露光時間が経過したら、ファンクションジェネレーターを手動でオフにします。タイマーを使用して時間を観察します。
   注:この研究で使用したHIFUビームの強度とエネルギーは、それぞれ2,810 W / cm²と84 J / mm²です。
7. 同時に、CMAP を記録しながら、電気生理学的取得システム (ステップ 1.3) を介して刺激を、HIFU システムを介して HIFU ビーム (ステップ 1.6) を坐骨神経に送達します。坐骨神経へのHIFU曝露を3秒、5秒から8秒に徐々に増やし、CMAPの振幅の減少または阻害が観察されるまで増やします。
   1. HIFU ビームの配信中に 1 秒に 1 回 CMAP を記録します。CMAPの振幅の変化を観察した後、HIFUシステムをオフにし、電気生理学取得ソフトウェアの記録アイコンを手動でクリックして、10分前半は2分ごと、連続30分は5分ごと、記録時間が2時間に達するまで最後のフェーズでは10分ごとにCMAPを記録します。
8. 神経固定器のコンポーネントIIとIIIを分離し(図2)、切開部位からHIFUトランスデューサーを取り外します。コンポーネント II と I を分離して、固定された坐骨神経を解放します。CMAPを記録した後、糖尿病ラットの手術部位を4-0クロムキャットガット縫合糸で縫合します。感染を防ぐために、液体ヨウ素を手術部位に塗布します。
   1. ケージを加熱パッドの上に置き、動物施設に戻す前にケージ内でラットが回復するのを待ちます。ラットに飲料水中のイブプロフェンを3日間提供するか、ブプレノルフィン(0.05〜0.1 mg / kg)を腹腔内注射します。
9. 最初のHIFU超音波処理後7、14、および28日目に、ステップ1.1.2および1.3で説明されているように、麻酔をかけた糖尿病性神経因性ラットの坐骨神経および腓腹筋の起点に刺激および記録電極を挿入します。

結果

図1:高密度集束超音波(HIFU)による生体内神経伝導ブロックの実験的セットアップ .(A) 逆浸透脱気水で満たされたカスタムメイドのアクリル球形コーンを神経固定器と組み合わせて、HIFU トランスデューサーの焦点ゾーンが神経の焦点面にあることを確認しました。(B)刺激電極と記録電極を図に示します。神経固定器は、坐骨神経を HIFU ビームの焦点面に配置しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Streptozototocin	Sigma	85882
Biopac MP36 取得システム	Biopac Systems, Inc.
HIFUトランスデューサーSonic	Concepts	H108
クションジェネレーターAgilent		33250A
パワーアンプ	エレクトロニクス&イノベーション	1040L
ラットBiolasco	taiwan Sprague-Dawley
ルーブ獣医軟膏Dechra
Isoflurane気化器	Parkland Scientific	V3000PS
ソフルラン	アタネ

ファンプライ