Caenorhabditis elegansのニューロンにおける細胞内カルシウムダイナミクスのイメージング

要約

出典: Doser, R., et al.in vivoでのニューロンカルシウムハンドリングの細胞内イメージングJ. Vis. 経験。(2023年)

このビデオは、トランスジェニックCaenorhabditis elegans株の腹側神経索ニューロンにおける細胞内カルシウムフラックスのin vivoイメージングを示しています。2つの異なるカルシウム指標が採用されています:ある株の細胞質指標と別の株のミトコンドリア指標です。ニューロンは蛍光顕微鏡で観察され、ニューロンの細胞質とミトコンドリア内の蛍光強度のリアルタイムの変化を監視し、自発的なニューロン活動中のカルシウムフラックスを反映します。

プロトコル

1.イメージング用のワームの準備

1. 寒天パッドの準備
   分子
   1. グレードの寒天をM9に溶解して3 mLの10%寒天を13 mm x 100 mmのガラス培養管に溶解し、電子レンジで数秒間加熱します.
      注。溶融寒天は、ヒートブロック上で最大1時間保管することも、寒天パッドが必要になるたびに新鮮にすることもできます。
   2. それぞれが2層の実験用テープを持つ2つの追加スライドの間に顕微鏡スライドを置きます(図1A-iを参照)。
   3. 1,000 μLのピペットチップ(フィルターなし)の先端を切断し、それを使用して寒天の小さな滴を中央のカバーガラスにピペットで移します(図1A-i)。
   4. 寒天の上に別のスライドを押し下げて、寒天を平らにします(図1A-ii)。
   5. 冷却後、13 mm x 100 mmのガラス培養チューブの開口部を使用して寒天を小さなディスクに切断し(図1A-iii)、周囲の寒天を除去します。
2. ウォームローリング溶液の調製
   1. ムシモール粉末をM9に溶解して、30 mMのストックを作成します。50 μLのアリコートに分離し、4°Cで保存します。
   2. 3〜5日ごとに30 mMムシモールの新しいアリコートを解凍します(使用中は20°Cで保存します)。
   3. 30 mMのムシモールストックをポリスチレンビーズで1:1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。
3. イメージング用のワームの配置
   1. 1.6 μLのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
      注:液体の量は、若い(少ない)または年配の動物(より多くの)をイメージングするために調整する必要があります。
   2. 好ましいワームピック(すなわち、ガラスまたはプラチナワイヤーピック)を使用して、多外陰部表現型のない所望の年齢のワームを寒天パッド上のローリング溶液に移します(図1A-iv)。手記。代表的なデータは、生後1日の雌雄同体(GCaMP6f株= FJH185;mitoGCaMP株;FJH597)、卵が1列しか存在しないことで識別できます。
   3. ムシモールがワームの動きを減らすまで~5分間待ってから、寒天パッドの上に22 mm x 22 mmのカバーガラスを落とし、ワームの動きを物理的に制限します。
   4. 腹側神経索の神経突起をイメージングするには、カバーガラスを軽くスライドさせて、ワームを図1Bおよび1Cに示す方向に転がします><。腹側神経索を視覚化するには、頭を上に向けてワームを配置し、腸がワームの近位部分の右側とワームの遠位部分の左側になるまでワームを転がします(見る人の視点から)。背側神経索の神経突起をイメージングするために、この方向を反転させます(図1C)。
4. 顕微鏡へのワームの取り付け
   1. 顕微鏡ステージに取り付ける前に、カバーガラスに浸漬油を一滴垂らします。
   2. 明視野で低倍率の対物レンズ(10倍)対物レンズを使用してワームを見つけます。
   3. 100倍対物レンズに切り替えて、フォーカスを調整します。
   4. 488 nmイメージングレーザーでGCaMPまたはmitoGCaMPの照明を使用してAVA神経突起を見つけます。
      注:ワームを押しつぶしたり、カバーガラスを引き抜いたりしないように、小さな調整を使用してください。

2. 高解像度画像ストリームの取得

1. In vivo GCaMP イメージング
   1. 露光時間を 20 ミリ秒に設定します。
   2. 基本的なGCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジの中間範囲になるまで、イメージングレーザーと取得設定を調整します。他の顕微鏡セットアップを使用してイメージングパラメータを最適化するための提案については、議論を参照してください。
      注:この研究で使用した光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 50%および減衰= 1。追加の集録設定を次のように変更します:EM電子乗算)ゲイン=200およびプリアンプゲイン= 1。
   3. 100倍の倍率でGCaMP蛍光を使用してAVA神経突起を特定した後、Zドリフト補正器(ZDC、 材料表を参照)を±30μmの範囲に設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージング前に、必要に応じて焦点面を手動で補正します。
   4. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。この研究で使用したセットアップでは、10 分という長さを達成できます。
2. in vivo mitoGCaMP imaging
   1. 必要に応じて手順 2.1.1 から 2.1.2 に従って、カメラのダイナミック レンジの中間範囲で基礎 mitoGCaMP 蛍光を取得します。
      注。この研究で使用した光学セットアップでは、488 nm イメージング レーザーを次の出力設定に設定します: レーザー出力 = 20%、減衰 = 10。集録設定を次のように変更します:EMゲイン=100、プリアンプゲイン=2。
   2. MITOGCaMP蛍光を使用してAVA神経突起のミトコンドリアを特定した後、上記の手順2.3で説明したようにZDCを設定します。
   3. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。

結果

図1:腹側神経索をイメージングするための C.エレガンスの取り付けと転がし。(A)寒天パッドを準備し、単一のワームをローリング溶液にピッキングする手順の図。(B)イメージングのために再配置される前のワーム位置の例。赤い矢印は、カバーガラスを右にスライドさせることで実現できるワームの右にロールする必要があることを示しています(青い...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100x/1.40 石油対物レンズ	オリンパス		UPlanSApo
10x/0.40 対物レンズ	オリンパス		UPlanSApo
22 mm x 22 mm カバーガラス	VWR	48366-227
アガロース SFR	VWR	J234-100G
CleanBench 実験台	TMC		振動制御付き
フィルターホイールまたはスライダー	ASI		直径25mmフィルター用
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	ワーム株
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	ワーム株
GFPバンドパス発光フィルター	Chroma		525 ± 50 nm (直径25 mm)
ILEレーザーコンバイナー	Andor Technologies		4レーザーライン
ILEソリッドステート488nmレーザー	Andor Technologies		50 mW
IX83 スピニングディスク共焦点顕微鏡	オリンパス		河電機 CSU-X1 スピニングディスク
iXon Ultra EMCCD カメラ	付きAndor Technologies
低自動蛍光浸漬オイル	オリンパス	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		バージョン 7.10.1
顕微鏡コントロールボックス	オリンパス		IX3-CBH
ムシモール	MP バイオメディカル / シグマ	02195336-CF
ポリビーズマイクロスフェア	ポリサイエンス	00876-15	0.094 μm
スタビリティチャンバー	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	15 °C に設定
ステージコントローラー	ASI		フィルターホイール制御付き
標準顕微鏡スライド	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
タッチパネルコントローラー	Olympus		I3-TPC
Zドリフト補正器	オリンパス		IX3-ZDC2

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