Caenorhabditis elegansのニューロンにおける細胞内カルシウムダイナミクスのイメージング

1.イメージング用のワームの準備

1. 寒天パッドの準備
   分子
   1. グレードの寒天をM9に溶解して3 mLの10%寒天を13 mm x 100 mmのガラス培養管に溶解し、電子レンジで数秒間加熱します.
      注。溶融寒天は、ヒートブロック上で最大1時間保管することも、寒天パッドが必要になるたびに新鮮にすることもできます。
   2. それぞれが2層の実験用テープを持つ2つの追加スライドの間に顕微鏡スライドを置きます(図1A-iを参照)。
   3. 1,000 μLのピペットチップ(フィルターなし)の先端を切断し、それを使用して寒天の小さな滴を中央のカバーガラスにピペットで移します(図1A-i)。
   4. 寒天の上に別のスライドを押し下げて、寒天を平らにします(図1A-ii)。
   5. 冷却後、13 mm x 100 mmのガラス培養チューブの開口部を使用して寒天を小さなディスクに切断し(図1A-iii)、周囲の寒天を除去します。
2. ウォームローリング溶液の調製
   1. ムシモール粉末をM9に溶解して、30 mMのストックを作成します。50 μLのアリコートに分離し、4°Cで保存します。
   2. 3〜5日ごとに30 mMムシモールの新しいアリコートを解凍します(使用中は20°Cで保存します)。
   3. 30 mMのムシモールストックをポリスチレンビーズで1:1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。
3. イメージング用のワームの配置
   1. 1.6 μLのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
      注:液体の量は、若い(少ない)または年配の動物(より多くの)をイメージングするために調整する必要があります。
   2. 好ましいワームピック(すなわち、ガラスまたはプラチナワイヤーピック)を使用して、多外陰部表現型のない所望の年齢のワームを寒天パッド上のローリング溶液に移します(図1A-iv)。手記。代表的なデータは、生後1日の雌雄同体(GCaMP6f株= FJH185;mitoGCaMP株;FJH597)、卵が1列しか存在しないことで識別できます。
   3. ムシモールがワームの動きを減らすまで~5分間待ってから、寒天パッドの上に22 mm x 22 mmのカバーガラスを落とし、ワームの動きを物理的に制限します。
   4. 腹側神経索の神経突起をイメージングするには、カバーガラスを軽くスライドさせて、ワームを図1Bおよび1Cに示す方向に転がします><。腹側神経索を視覚化するには、頭を上に向けてワームを配置し、腸がワームの近位部分の右側とワームの遠位部分の左側になるまでワームを転がします(見る人の視点から)。背側神経索の神経突起をイメージングするために、この方向を反転させます(図1C)。
4. 顕微鏡へのワームの取り付け
   1. 顕微鏡ステージに取り付ける前に、カバーガラスに浸漬油を一滴垂らします。
   2. 明視野で低倍率の対物レンズ(10倍)対物レンズを使用してワームを見つけます。
   3. 100倍対物レンズに切り替えて、フォーカスを調整します。
   4. 488 nmイメージングレーザーでGCaMPまたはmitoGCaMPの照明を使用してAVA神経突起を見つけます。
      注:ワームを押しつぶしたり、カバーガラスを引き抜いたりしないように、小さな調整を使用してください。

2. 高解像度画像ストリームの取得

1. In vivo GCaMP イメージング
   1. 露光時間を 20 ミリ秒に設定します。
   2. 基本的なGCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジの中間範囲になるまで、イメージングレーザーと取得設定を調整します。他の顕微鏡セットアップを使用してイメージングパラメータを最適化するための提案については、議論を参照してください。
      注:この研究で使用した光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 50%および減衰= 1。追加の集録設定を次のように変更します:EM電子乗算)ゲイン=200およびプリアンプゲイン= 1。
   3. 100倍の倍率でGCaMP蛍光を使用してAVA神経突起を特定した後、Zドリフト補正器(ZDC、 材料表を参照)を±30μmの範囲に設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージング前に、必要に応じて焦点面を手動で補正します。
   4. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。この研究で使用したセットアップでは、10 分という長さを達成できます。
2. in vivo mitoGCaMP imaging
   1. 必要に応じて手順 2.1.1 から 2.1.2 に従って、カメラのダイナミック レンジの中間範囲で基礎 mitoGCaMP 蛍光を取得します。
      注。この研究で使用した光学セットアップでは、488 nm イメージング レーザーを次の出力設定に設定します: レーザー出力 = 20%、減衰 = 10。集録設定を次のように変更します:EMゲイン=100、プリアンプゲイン=2。
   2. MITOGCaMP蛍光を使用してAVA神経突起のミトコンドリアを特定した後、上記の手順2.3で説明したようにZDCを設定します。
   3. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。

図1:腹側神経索をイメージングするための C.エレガンスの取り付けと転がし。(A)寒天パッドを準備し、単一のワームをローリング溶液にピッキングする手順の図。(B)イメージングのために再配置される前のワーム位置の例。赤い矢印は、カバーガラスを右にスライドさせることで実現できるワームの右にロールする必要があることを示しています(青い矢印)。スケールバー = 50 μm。(C) 腹側神経索を視覚化するために必要な正しい向き。注:腸は、近位半分の見る人の右側(直立顕微鏡を使用)にあり、次に遠位半分の左側にあります。