セルカリア変換と in vitroで栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

サマリー

我々は、説明 in vitroで方法マンソン住血吸虫、淡水カタツムリ中間のホストビオンファラリア属のglabrataから感染セルカリアの収穫とトランスフォーメーションによる。

要約

住血吸虫寄生虫は住血吸虫症の原因物質、世界的に2億人以上の人々に影響を与え、公衆衛生と社会経済的インパクト（1-4）の点では寄生虫疾患の中でマラリアに次ぐ慢性的に衰弱させる病気です。住血吸虫寄生虫は自由遊泳性の段階が介在すると軟体動物と哺乳類宿主における寄生生活の間で交換する複雑な生活環を持つ吸虫ワームです。簡単に言えば、自由遊泳性のセルカリアはschistosomulesに変換、セルカリアは彼らの尾を失い、その間、分泌されるプロテアーゼの助けを借りて、皮膚を​​貫通することによって哺乳動物宿主に感染する。 schistosomulesは、宿主免疫システムを回避する赤血球の消化のための腸を開発し、移行する必要がありますしかし、肺および肝門脈系の最終的な宛先に向かう途中門脈循環および最終的に腸間膜静脈（S.マンソン用）ここで、男性と女性のワームのペアとチームメイト、毎日卵の何百もの生産。卵の一部は、自由遊泳miracidiumの複数形（5-10）に卵の孵化新鮮な水、体内から排泄される。 miracidiumの複数形は、特定のカタツムリの種に感染し、順番に、ライフサイクルを完了、感染のセルカリアを生み出す母と娘sporocysts、変身。残念ながら、全体の住血吸虫のライフサイクルは 、in vitro で培養することはできませんが、感染性のセルカリアはschistosomulesに変換することができる、とschistosomulesは、 インビトロまたはマイクロアレイ解析における住血吸虫開発の分析のために週間培養することができます。このプロトコルでは、我々はセルカリア変換とschistosomules の in vitro培養での視覚的な説明を提供します。私たちは、カタツムリのホストビオンファラリア属のglabrataから感染セルカリアを当てると手動で乳化両頭針を使用して尻尾を切り離して、schistosomulesに変換すれば良い。 体外セルカリア変換とschistosomules培養技術で 、住血吸虫の可視化を簡素化し、実験的な分析のために寄生虫の収集を容易に。vitroでの変換と住血吸虫の培養技術で年間行われている哺乳動物宿主、（11の使用を避ける説明12）が、コミュニティ全体で利用できる開発されている視覚的なプロトコル。

プロトコル

安全対策：

住血吸虫セルカリアは直接カットや毛穴のニーズなく皮膚に浸透する、と慢性疾患の住血吸虫症を引き起こす可能性があります。S.マンソンは、バイオセーフティレベル2微生物であり、そのため感染のセルカリアで作業する場合、適切な個人用保護具と適切な安全対策に従う必要があります。住血吸虫の成長と変革するために必要な機材のほとんどは、プロトコルの末尾の表に記載されているいくつかの重要な例外を除いて、標準です。すべてのセルカリアの仕事は、隔離された部屋で行われるべきです。 Schistosomulesは、滅菌、承認されたバイオセーフティフードで培養する必要があります。実験用の上着、靴、穴や涙なしのパンツ、そして手首と腕用の防水スリーブプロテクタの防水ペアが必要として、ニトリルやラテックス手袋の二層は、着用してください。偶発的な流出の場合には、すぐにあなたの人になら、激しくこすり、70％エタノールまたは10％漂白剤で汚染されたエリアをスプレー。これは、寄生虫を無効にして十分ですが、すべての可能な感染症が報告され、真剣に取られるべきである。 schistosomulesが本質的に感染性はないが、制度的なガイドラインは変わる、とBSL2注意が非感染性の生命の段階で必要とされているかどうかを決定するために調べられるべきである。実験が行われ、承認バイオハザード容器に廃棄物を廃棄された後に感染性物質と接触するすべての表面を消毒する。

注記：カバーのカタツムリのホストのビン1〜2日前に捨て、光から保護するために

1。カタツムリのホストからセルカリアを収穫

1. 室温に蒸留水で半分フル洗剤の自由なきれいな、500ミリリットルビーカーを埋める。別の日にmiracidiumの複数形に感染したホストのカタツムリで作業する場合、（カタツムリが将来の実験のために再利用される場合、これは特に重要です）それぞれの感染の日付ごとに別々のビーカーを使用してください。ビーカーの大きさはまたユーザーの経験に応じて小さくすることができます。
2. あなたが当てると慎重に、必要に応じて標準的な観賞魚ネットと汎用の鉗子を用いてビーカーにそれらを堆積する感染カタツムリのホストを収集する。
3. 緊急時の流出の上に置いてビーカーは白熱光源の下に約8〜12インチをトレイ。光の下で1-2時間放置する。明るい光にさらされるとセルカリアは、カタツムリのホストを終了します。
4. 慎重にセルカリアの混合物からカタツムリを除外。混合物は非常に感染であるため、余分な安全予防策を講じる。 忘れないで、セルカリアは直接人間の皮膚に浸透することができます！
5. 任意の粒子の廃棄物が解決できるように、約15分間の光源下で混合物を交換してください。
6. ビーカーの底に破片を避け、ピペットを用いてきれいな三角フラスコにセルカリアを転送します。 60分、セルカリアが一角に定着できるようにすること - 45のための暗所で氷上で約45 °の角度でフラスコを置きます。
7. 上清の75〜90％を除去し、10％の漂白剤または70％エタノールを入れたビーカーにそれを預ける、水滴がピペットからセルカリアのドリップを含むように注意しながら、50 mLのピペットを使用してください。
8. スワール三角フラスコは、溶液中のセルカリアを再懸濁させる優しくセルカリアを含む。滅菌50 mlコニカルチューブにサンプルを転送するためにピペットを使用してください。暗所で20分間氷上で再びチューブを置きます。セルカリアは暗闇の中でチューブの底に向かって沈殿します。

2。 schistosomulesにセルカリアの手動変換

作業を始める前に：RPMI 1640で完了（RPMI、5％ウシ胎児血清、1 ×ペン/連鎖球菌）と37℃まで暖かくしてください（これは、住血吸虫は、補完するように注意を払う必要があるとして使用されるウシ胎児血清で1時間インキュベーション56℃で不活性化されていることが重要です）。

1. バイオハザードフードでは、ピペッターまたは真空装置を使用して、各50 mlコニカルにおけるソリューション5〜10mlにダウン上清を取り除く。
2. 適切なサイズのシリンジに22ゲージダブルエンド、ルアーロック乳化針を取り付けます。
3. ゆっくりと注射器に混合物を描く。シリンジ内のすべての50 mlチューブからセルカリアを収集する。滴下の気配りである。
4. 慎重にアタッチされていない針の端が上になるように上の注射器を回します。乳化針のこの側面に別のシリンジを取り付けます。
5. セルカリアを変換するために針を通して40倍（20倍前後に）の合計を混合して渡す。
6. 混合物が底の注射器に含まれており、トップシリンジが空であることを垂直にそのような注射器を置きます。トップシリンジを外し、70％エタノールで消毒。
7. きれいな高い壁に囲まれた100ミリメートルx 50mmのパイレックスの皿または結晶皿の中にドロップによる預金の混合物をドロップ。 70％エタノールで針と注射器を消毒する。
8. 37℃のRPMI 1640完全なメディアがそのようなこと追加ルリアブロスプレートを注ぐかのようにペトリ皿の底は完全に、覆われている。
9. ペトリ皿の中央にschistosomulesを収集するために穏やかに渦巻く。水はねを避ける。
   注：これは、より適切に中央にschistosomulesを視覚化するこのステップのためにボンネットのライトをオフにすると便利かもしれません。
10. 直ちに滅菌スポイトを使用しても新鮮な12ウェル細胞培養プレートに集中schistosomulesを入金。
11. schistosomulesが皿の中心（約10倍）で、もはや存在しなくなるまで、2.9、2.10繰り返します。新鮮なだけでなく後続の各コレクションを入金。
12. よく、最大半分（〜1.5 mL）に温めておいたRPMI完全培地でそれぞれを埋める。
13. schistosomulesとセルカリアの不在の存在を確認するために倒立顕微鏡で視覚化する。
14. 成長するCO ₂インキュベーターでschistosomulesは37に設定されて℃、5％CO _2。

3。代表的な結果：

培養培地に変換schistosomulesの転送、保留中、反転明視野顕微鏡（例えば、機器の表を参照）の下で可視化は、変換schistosomulesがよく中に存在する1を、図に類似した画像を生成する必要があります。潜在的な汚染物質がそのままセルカリア、切断セルカリア尾、または他の破片を含めることができます。は倒立顕微鏡が利用できない場合は、標準的な顕微鏡あるいは解剖スコープはschistosomulesを可視化するために十分であろう。この手順は常にセルカリアの100％を変換しないことに注意してください。

図1：変換された幼住血吸虫

図2：セルカリアと断絶された尾

ディスカッション

いくつかの潜在的な問題は、変換手順の実行中に発生する可能性がありますが、このプロトコルは、これらの問題のほとんどを回避するために設計されています。つの潜在的な危険は、通常、ステップ1.3の収穫から残っている破片のために生じた乳化針の目詰まりです。ステップ1.5で解決すると、ステップ1.6で慎重にセルカリアを転送するすべての粒子状物質は、この問題を回避できるようにしてください。また、のような生物学的安全キャビネット内部の作業、前に説明した、個人用保護具の使用（さえフェイスシールド）と注射器の過度の圧力の回避が望ましい。

切り離されたセルカリア尾は、ステップ2.9の間に貧困層の分離の指標である、メディアで視覚化することができます。尾は、痙攣のような動きを示すと（図2を参照）異なる形状を有し、そしてマンドリーバschistosomulesと簡単に区別できます。尾はschistosomulesが解決できるように完全RPMIを超えるschistosomulesを洗浄することによって除去することができます。尾はフローティングのままとなり、オフバキュームすることができます。

無傷のセルカリアがメディアに存在する場合、ステップ2.5での変換が正しく実行されませんでした。無傷のセルカリアの画像は参考のため図3bに示されている。この問題が発生した場合は、使用されている乳化剤針が適切なサイズであることを保証する。 40倍が一般的に十分なセルカリア尾の100％のせん断にアプローチするよりもはるかに多くのですがまた、セルカリア混合物が針を通過する回数は、増加することができます。

schistosomulesにセルカリアの転換は、最初のコリーとWikel（13）によって1974年に記述されていた。それ以来、schistosomulesの調製は、このプロトコルで説明されているように、針と注射器との併用でもせん断戦略を使用して、またはボルテックスアプローチを使用し、パーコールの勾配（14、15）で区切ったり、本論文で示すように渦巻いて行われてきました。準備schistosomulesのためのこれらの2つのテクニックは、美しくフレッドルイス（16）によって記述されており、長期的な成長のためのschistosomulesのさらなる培養のための詳細については、NIAID住血吸虫リソースセンター（で見つけることができますwww.schisto - resource.org ）。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
22グラムX 2-7/8"乳化針	フィッシャーサイエンティフィック	14から825 - 17G
RPMI 1640培地1X（500ミリリットル）	インビトロジェン	11835030
ウシ胎児血清（FBS）熱不活化	インビトロジェン	10082139
ペニシリン/ストレプトマイシン（100X）	インビトロジェン	15070063
結晶皿（100ミリメートル）	フィッシャーサイエンティフィック	08 - 741D
汎用ピンセット	フィッシャーサイエンティフィック	10 - 316C
ブラインシュリンプのためのペトコ水族館ネット	ペトコ	SKU：1190954