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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. P0-P2マウス脳の除去
- 手順を開始する直前に、いくつかのシャーレに冷やした炭酸素化スクロース人工脳脊髄液(sACSF)を入れます。また、収集チューブに~25 mLのsACSFを充填します。
- 生後0〜2日目(P0-P2)の子犬をパラフィルムまたは手袋で包み、氷の下にしっかりと覆います。タイマーを5分に設定して起動します。その後、子犬を取り外し、後足をつまんでも反応しないことを確認します。
- 子犬の首を切り、sACSFで満たされたシャーレに頭を集めます。正中線に沿って皮膚を切断して頭蓋骨を露出させます。
- 後脳/脊髄の頭蓋骨の開口部を見つけ、鉗子の一端を頭蓋骨の背側部分に沿って挿入します。正中線で頭蓋骨をそっとつかみ、脳を損傷しないように注意しながら、横方向に断片を「剥がして」脳を露出させます。
- 頭蓋骨の背側部分と外側部分を切除したら、鉗子またはへらを使用して、脳の腹側表面の下にすくい取り、頭蓋骨から脳をそっと取り除き、どの領域にも損傷を与えないようにします。脳を炭酸素化sACSFで満たされた別のシャーレに入れます。手記：海馬、線条体、皮質を解剖するための2つの異なる戦略を提示します。最初の戦略(ステップ2.1〜2.10)は任意のマウス系統に有用ですが、2番目の戦略(ステップ3.1〜3.7)は、線条体を淡蒼球および他の脳構造からきれいに分離するために蛍光レポーターマウスを必要とします。線条体が望ましくない場合は、2つの技術の線条体固有の部分を無視します2
。線条体、海馬、皮質を収穫する、テクニック #1
- 脳全体をセクショニング マトリックス型の上に置き、腹側を上にします。カミソリの刃1本を脳の最前部(前嗅覚路を通って)に通します。
- 最初のカミソリの刃のすぐ後ろに別のカミソリの刃を挿入して0.5mmのスライスを生成し、このカミソリの刃の後ろに追加のカミソリの刃を置きます。
- これらのスライスを炭酸素化sACSFの入ったシャーレに移し、脳の残りの部分をsACSFの入った別の皿に入れます。線条体スライスを解剖スコープに移して、線条体を視覚化します。これらのスライスには、前線条体の大部分が含まれており、海馬が欠けている必要があります。Nkx2.1-Cre+/-で蛍光解剖スコープを使用します。淡蒼球の強いtdTomatoシグナルから弱い線条体tdTomatoシグナルを区別するためのAi9+/-スライス
- 蛍光の有無にかかわらず、すべての切片の両半球から線条体をつまんで取り出し、線条体の塊をsACSFで適切に標識された50 mLチューブに移し、氷上に保存します。
- 鉗子またはカミソリの刃を使用して正中線に沿って脳を半分離し、内側表面が上を向くように半球を置きます。
- 腹側脳組織(視床、大脳基底核など)を鉗子でつまんで取り除きます。完了すると、海馬(背側皮質に沿って前後軸にまたがるソーセージ型の構造)と皮質の心室側がはっきりと見えるはずです。
- 海馬を取り除くには、鉗子の先端を前海馬の前に挿入し、鉗子を後方に動かし、海馬と皮質の境界に沿ってつまんで、海馬を皮質からそっと分離します。単離された海馬をsACSFで適切に標識された50 mLチューブに移し、氷上に保存します。
- 皮質を解剖するには、半切開された皮質の内側を下に置きます。次に、鉗子を使用して皮質の最も背側、腹側、前部、および後部をつまんで、内側体性感覚皮質の正方形の塊を~2 mm x 2 mm残します。必要に応じて、内側が上になり、内側表面の余分な非皮質組織(視床、大脳基底核など)が取り除かれるように皮質を裏返します。皮質チャンクをsACSFで適切に標識された50 mLチューブに移し、氷上に保存します。
- もう一方の半球で手順を繰り返して、海馬と皮質の両方の領域を収集します。
- すべての子犬に対してこの手順を繰り返し、子犬の間のシャーレ内の sACSF を必ず交換して、sACSF が冷たく新鮮な状態を保つようにします。
3.線条体、海馬、皮質を採取する、テクニック#
- 2sACSFを含むシルガードコーティングされたシャーレに脳の腹側を下にして置き、小脳と前皮質または嗅球を通して固定します。
- 片方の半球から始めて、湾曲した鉗子を使用して、後皮質を下にある海馬や他の組織からそっと分離します。皮をむいた皮質をシャーレの上にそっと平らに置きます。もう一方の半球についても繰り返します。海馬と線条体は、露出した脳にはっきりと見えるはずです。
- 鉗子を使用して正中線で海馬の片方をつまみ、海馬を横方向に剥がして取り除きます。氷の上の収集バイアルに入れ、他の海馬で繰り返します。
- 線条体の場合は、線条体の端をそっとこすり、周囲の組織からほぐします。次に、線条体を下からつまんで取り除き、氷の上で採取チューブに加えます。もう一方の線条体についても繰り返します。
- 皮質切片は、ステップ2.8で説明されているように採取できます。
- トランスジェニックレポーターマウスライン(例えば、Nkx2.1-Cre;Ai9、Lhx6-GFPなど)、線条体をsACSFでシャーレに移し、蛍光解剖スコープ下で観察します。鉗子を使用して線条体から非線条体組織を除去します (Nkx2.1-Cre;Ai9マウスは、淡蒼球が線条体と比較してはるかに高い内側神経節隆起またはMGE由来のtdTomato+細胞密度を持っているため、すべての「明るい」組織を除去します。すべての線条体について繰り返します。
- すべての子犬に対してこの手順を繰り返し、子犬の間のシャーレ内の sACSF を必ず交換して、sACSF が冷たく新鮮な状態を保つようにします。
4. 単一細胞解離の生成
- 解剖が完了したら、10 mg のプロナーゼを秤量し、10 mL の炭酸素化 sACSF に溶解して、1 mg/mL のプロナーゼ溶液を調製します。
- 組織を50 mLの収集バイアルから、2 mLのプロナーゼ-sACSF溶液を含む5 mLの丸底チューブに移します。組織を室温で20分間インキュベートし、インキュベーション中にチューブを指で3〜4回振ったりフリックしたりしてサンプルを混合します。
- このインキュベーション中に、再構成溶液を調製します:1%ウシ胎児血清(FBS、100 μL)+ DNAse(1:10,000ストックDNAse 1 μL)を10 mL炭酸素化sACSF中。
- 20分後、底の組織を乱さないようにプロナーゼ溶液を慎重に取り除き、1〜2 mLの再構成溶液と交換します(総量は組織の開始量によって異なります)。
- 事前に調製した火で研磨されたパスツールピペットで組織を粉砕することにより、組織を機械的に解離します。大口径(~600 μm)ピペットから始めて、組織溶液を少なくとも10回吸引して排出し、組織を分解します。溶液に気泡を混入させないでください。中口径ピペットと小口径ピペットに対してこのプロセスを繰り返します。溶液は濁っている必要があり、収集チューブに透明な組織片が見えてはなりません。
- 細胞溶解液を50 μmフィルターを通して5 mLコニカルチューブにピペッティングし、細胞の塊を除去します。これらの単一細胞溶液を使用してフローサイトメトリーに進めます(または、選別が不要な場合は直接細胞計数に進
めることができます)。
5. 移植用の蛍光活性化細胞選別(FACS)精製細胞溶液の調製
- フローサイトメーターから細胞溶液を受け取ったら、溶液を1つ(または複数)の1.5 mLコニカルチューブに移し、細胞を500 gで4°Cで5分間回転させます。遠心分離後、~20〜40 μLがチューブ内に残るように培地を取り除きます。この残りの培地で細胞を再構成します(複数のチューブが必要な場合は溶液を結合します)。
- パラフィルムの小片に、2 μLの細胞溶液+ 8 μL sACSF + 10 μLのトリパンブルー染色剤を混ぜ合わせます。スライドカバー付きの血球計算盤に10 μLをピペッティングします。
- 標準的な実験室のハンドタリーカウンターを使用して、血球計算器の隅にある4 x 4の正方形のグリッドのそれぞれにある生細胞の数を数え(死細胞は色素から青くなります)、これらの4つのカウントを平均化します。この数値に100を掛けて、μLあたりの細胞数を決定します。
- 必要に応じて、細胞が再構成溶液中の濃度が10,000〜30,000細胞/μLになるように容量を調整します。最終濃度は、細胞の総量と希望する移植回数によって異なります。移植のために細胞を氷上に置いておく
6.P0-2 WTの子犬への移植
- 野生型(WT)の子犬をパラフィルムまたは手袋で包み、氷の下にしっかりと覆います。タイマーを5分に設定して起動します。その後、子犬を取り外し、後足をつまんでも反応しないことを確認します。
- 子犬が氷の上にいる間に、細胞溶液を数回ピペッティングして混合し、ローディング前に細胞懸濁液が十分に混合されていることを確認します(注射ごとにマイクロピペットをロードする前に細胞を混合します)。次に、マイクロピペットから鉱物油を空にし、細胞懸濁液で完全に満たします。
- 麻酔をかけた子犬をシャーレの上に置き、頭のてっぺんが比較的平らになるように頭を粘着パテの上に置きます。ダイヤモンドの穴の開いたテープを子犬の頭に置き、ぴんと張って引っ張って、皮膚が伸びて頭がしっかりしているが、マウスが快適で呼吸がしっかりしていることを確認します。ラムダはダイヤモンドの穴から見えるはずです。
- 固定された子犬をNanojectの下に移動させ、マイクロピペットの先端がラムダの真上になるようにマイクロピペットを下げます。マニピュレータに x-y 座標を記録します。
- マニピュレーターノブを調整して、マイクロピペットを頭の中外側軸と前後軸に沿って目的の座標に移動します:一次体性感覚皮質またはS1皮質→前方1.0 mmおよび外側1.0 mm、海馬→前方0.75〜1.0 mmおよび外側1.0〜1.2 mm、線条体→前方2.0〜2.2 mmおよび外側1.5 mm。子犬の年齢(例えば、P0対P2)またはマウスの系統(例えば、CD1マウスがP2でC57/B6より大きい)を補正するために、座標をわずかに調整することができます。
- マイクロピペットが皮膚に小さな凹みを形成するまで下げます。次に、Z軸マニピュレーターノブをしっかりと、しかし優しく回して、マイクロピペットを皮膚と頭蓋骨に通して脳に入ります。マイクロピペットが脳に入ると、頭蓋骨への圧力が解放され、凹みが消えます。
- 先端がテントのような形をした皮膚の円錐形に囲まれるまで、マイクロピペットを少し引っ込めます。z軸に沿った座標を読みます:これはz軸のゼロ点になります。
- マイクロピペットを希望の深さまで下げます:皮質→0.75〜1.0 mm、海馬→1.2〜1.5 mm、線条体→2.0〜2.5 mm。深さは、子犬の年齢や緊張を補うためにわずかに調整できます。
- 上記のNanoject IIIプログラムを使用して細胞懸濁液を注入します。注射プログラムが完了したら、15〜20秒待ってからマイクロピペットをゆっくりと引っ込めて、注射部位からの溶液の漏れを最小限に抑えます。
- 両側注射を行う場合は、ラムダの上のマイクロピペットを再びゼロにし、もう一方の半球の適切な座標に移動します。あるいは、マイクロピペットを最初の注射の1mm前方に動かすことにより、同じ半球の皮質に2回注射を行うこともできます。
- 移植が完了したら、テープを剥がし、子犬を加熱パッドに移します。必要に応じて、尻尾またはつま先のクリッピングで子犬にタグを付けます。子犬が赤い色を取り戻して動いたら、母親と一緒にケージに戻します。