感覚軸索再生を促進するマウス後根核のエレクトロポレーション媒介トランスフェクション

要約

出典: Li, Q. et al.ほ乳類の軸索再生の研究 成体マウス後根神経節のin vivoエレクトロポレーションJ. Vis. 経験。(2018年)

このビデオでは、軸索再生を研究するためのマウスDRGニューロンのエレクトロポレーション媒介トランスフェクションを示します。核酸構築物をDRGニューロンに送達し、坐骨神経損傷を誘発し、軸索再生を評価するための手順を概説します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 後根神経節(DRG)注射
   麻
   1. 酔液(終濃度20mg/mLの滅菌生理食塩水中に希釈したアベルチン、アベルチン200mg/kg体重)を腹腔内に注射し、DRG注射前に麻酔を維持します。
   2. デオキシリボ核酸(DNA)プラスミドまたはリボ核酸(RNA)オリゴ(DRGあたり1 μL)をガラスキャピラリーピペットにロードします。
   3. キャピラリーガラスピペットの先端をDRGに慎重に挿入します。
   4. 細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステム(30 psi、8 ms)を使用して、DNAプラスミドまたはRNAオリゴの1.0 μL溶液をDRGに徐々に注入します。
      注:注射時間は5分以上続く必要があります。
2. エレクトロポレーション
   1. 電極の先端にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を滴下します。
   滅
   2. 菌した角綿ガーゼで出血をきれいにします。
   3. ターゲットDRGを電極でそっとつまみ、エレクトロポレーションシステムで5つの正方形の電気パルスを印加します。
   4. 筋肉層と皮膚層をそれぞれ5-0ナイロン縫合糸で閉じます。
   5. マウスを加熱したブランケット(35.0°C)の上に置き、胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を完全に回復するまで、細心の注意を払います。マウスが麻酔から完全に回復したら、マウスをホームケージに戻します。
      注:マウスが37°Cのブランケットでの麻酔から完全に回復するまでに約60分かかります。イブプロフェン1錠(200mg)を1,000mlの水(0.2mg/ml)に溶かして毎日飲み、術後の痛みを和らげます。
3. 坐骨神経クラッシュ
   1. DRGエレクトロポレーションの2〜3日後(実験計画によって異なります)、麻酔液(アベルチン400 mg / kg体重)でマウスを腹腔内に麻酔します。
   2. コルクボードにマウスの四本の手足をテープ
   で貼ります。
   3. 正中線に沿って左側に0.5cmの切開を1cm行います。大殿筋や梨状筋などの筋肉を縦方向に切断します。大坐骨孔と坐骨切痕の間の坐骨神経のセグメントを露出させます。
   4. 顕微手術鉗子で神経を12秒間粉砕し、10-0ナイロン神経上縫合糸で圧傷部位に印を付けます。硬膜に結び目を作り、クラッシュ部位をマークします。
   5. 筋肉と皮膚の層を5-0ナイロン縫合糸で閉じます。
   6. マウスを加熱した毛布(35.0°C)の上に置き、胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を完全に回復するまで細心の注意を払います。マウスが麻酔から完全に回復したら、マウスをホームケージに戻します。
      注:マウスが37°Cのブランケットでの麻酔から完全に回復するまでに約60分かかります。イブプロフェン1錠(200mg)を1,000mlの水(0.2mg/ml)に溶かして毎日飲み、術後の痛みを和らげます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ECM 830 方形波エレクトロポレーションシステム	BTX Harvard Apparatus	45-0052	in vivo エレクトロポレーション用
Tweezertrodes 電極	BTX Harvard Apparatus	45-0524	in vivo エレクトロポレーション用、1 mm フラット
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	細胞内マイクロインジェクション ディスペンス システム
ホウケイ酸ガラス キャピラリー	World Precision Instruments, Inc.	1902328
ステレオ解剖顕微鏡	ライカ	M80
顕微手術鉗子	FST by DUMONT、スイス	11255-20	坐骨神経圧傷専用
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm、標準壁
テープ	フィッシャーブランド	15-901-30	マウスをコルクボードに固定するため
2, 2, 2-トリブロモエタノール (アバーチン)	シグマ・アルドリッチ	T48402	アバーチン原液
2-メチル-2-ブタノール	シグマ・アルドリッチ	152463	アバーチン原液
siRNA 蛍光ユニバーサルネガティブコントロール #1	シグマ・アルドリッチ	SIC003	によるノンターゲットsiRNA
Dy547によるミミックトランスフェクションコントロール	Dharmacon	CP-004500-01-05	を使用したノンターゲットマイクロRNA
	Invitrogen Purelink	K210016	GFPコーディングプラスミド調製
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	注射中のDRGアウトラインの可視化
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	麻酔導入
キシラジン	AnaSed	NDC 59399-110-20	酔導入
アセトアミノフェン	マクニール コンシューマーヘルスケア	NDC 50580-449-36	術後の痛みの緩和

蛍光microRNA 蛍光プラスミド調製キット 麻