共焦点顕微鏡イメージングを用いた樹状突起棘の定量化

要約

出典: Gouder, et. al.ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量化J. Vis. 経験。(2015)。

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用した形質導入された免疫標識錐体ニューロンにおける樹状突起棘のイメージングと分析を示します。バックグラウンドノイズが低減され、樹状突起の直径と長さを推定することで樹状突起がトレースされます。自動スパインセグメンテーションには、樹状突起とスパインの寸法のパラメータの設定とスパインの分類が含まれます。3D モデルが生成され、解析用にエクスポートされます。

プロトコル

1. ニューロン培養

1. ガラスカバーガラスで6ウェル培養プレートをポリオルニチン(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1/6に希釈、ストック濃度0.01%で一晩(O / N)処理し、続いてDPBSで3回洗浄します。次に、ラミニン(ストック濃度1 mg / ml、DPBSで500倍に希釈)をフローフードの下で少なくとも10時間加えます。
2. 神経幹細胞(NSC)を、Dulbeccoの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12またはDMEM/F12(500 ml)、N2サプリメント2バイアル(各5ml)、B27サプリメント2バイアル(各10 ml)からなる3 mlの培地にガラスカバーガラスを備えた6ウェル培養プレートでプレートし、ディスパッチします。 10 mlのペン-ストレプトマイシン(ペニシリン= 10,000単位/ mlおよびストレプトマイシン= 10,000単位/ ml)、1 mlの2-メルカプトエタノール(ストック溶液:50 mM)およびラミニン(1/500)、成長因子なし。
   重要なステップ:このステップは、細胞のクラスタリングを減らすために、ゆっくりと回転する動きで細胞を追加することにより慎重に実行します。
3. 培地を取り除きます。2 μg/ml の新鮮なラミニン溶液を含む新鮮な N2B27 培地を加えて、ニューロンをガラスカバーガラスに付着させ、凝集を防ぎます。培地は3日ごとに交換してください。細胞の乾燥を防ぐために、新鮮な培地を追加する前に、残りの培地の一部(200 μl)を保持してください。または、急速に進めて、総容量(3ml)を変更します。

2.レンチウイルス形質導入

注

:緑色蛍光タンパク質(GFP)発現は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターによって駆動されます。この研究では、ウイルス力価は400 ng / μl(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x中のストック溶液)でした。

1. 培養ウェル(6ウェルプレート)あたり40 ngのGFPレンチウイルスベクターを含むストック溶液1 μlを添加することにより、ウイルス粒子による成熟の任意の段階でヒト人工多能性幹細胞またはiPS細胞由来のニューロンを形質導入し、新鮮な培地で48時間インキュベートします。注:このプロトコルでは、インキュベーションの期間により、脊椎構造の良好な標識が可能になります。

3. 免疫蛍光

注

: 脊椎全体の形態の標識を改善するために、透過処理条件下で抗 GFP 抗体を使用して免疫蛍光標識を行いました。

1. 培地を除去し、形質導入された細胞をカバーガラス上の4%パラホルムアルデヒドで室温またはRTで10分間固定し、1x PBSで3回(各10分)
洗浄します。
2. カバーガラスを、0.05%トリトン(100倍)および10%馬血清を添加したPBSにRTで1時間浸漬し、1x PBSで3回洗浄します。
3. GFPに対して上昇し、各カバーガラスに1,000倍に希釈した4%ウマ血清と一次抗体(1/1,000)を添加した1x PBS 100 μlを加えます。暗い箱O/Nで4°Cでインキュベートし、1x PBSで3回洗浄します。
4. Alexa Fluor 488 結合抗体 (1/200) を 0.5% Tween 20 を添加した PBS で希釈し、室温で 1 時間インキュベートします。次に、1x PBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡用の封入剤を使用してスライドガラスにカバーガラスを取り付けます。

4. 樹状突起脊椎イメージング

1. : 共焦点レーザー走査顕微鏡による共焦点イメージングを実行します。
2. 錐体形態と完全な樹状突起樹林化を持つ健康なニューロンを選択し、別の実験から条件ごとに少なくとも10個のニューロンを定量化します。樹状突起あたり60〜100μmを定量化します。
3. 40X オイル NA = 1.3 対物レンズと GFP 励起用の 488 nm レーザー ラインを使用して画像を取得し、サンプル レベルでの標準ピーク パワーは約 20 μW です。樹状突起棘を適切にサンプリングするために、ピクセル サイズを約 80 nm に設定します。
   注: その後の分析では、ノイズが樹状突起と棘の適切なセグメンテーションを損なわない画像が必要です。上記の空間サンプリングとパワー設定により、3.15 μsのピクセル滞留時間で、そのような画像を構築するのに十分な光子を収集するのに十分であることが観察されました。薄暗いサンプルの場合、平均2〜4回のスキャンで画質を向上させることができます。関心領域をカバーするために複数のXYタイルを取得する必要がある場合があり、処理する前にそれらをつなぎ合わせる必要があります。
4. ニューロン体積全体をサンプリングするには、150 nmから300 nmの範囲のZ間隔でZスタックを取得し、20〜30個のZスライスを生成します。
   注:これらの設定で達成される横方向の空間分解能は234 nmで、軸方向の分解能は591 nmです。ここで選択したサンプリングは適切ですが、軸方向の分解能は画像化されるスパンの最小サイズよりも大きいため、解析では樹状突起から横方向に伸びるスパインが優先されます。

5. 3D 樹状突起棘の定量化

注

:次のセクションでは、分析のためのImarisソフトウェアの使用について具体的に説明します。NeuronStudio や Metamorph などの代替実装も存在し、同様の結果を提供できます。

次の主要な設定を使用します。

1. 前処理段階として、ガウスフィルタリングは、ソフトウェアによって提供される画像処理機能を介して使用されます。ガウスフィルター>画像処理>平滑化によるガウスフィルタリングを実行します。フィルター幅をピクセルサイズ(XY)に等しく設定します。
2. ソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールを使用して、樹状突起の半自動トレースを実行します。
   1. まず、ソフトウェアの[スライス]タブの距離ツールを使用して、樹状突起の直径を推定します。
   [
   2. Surpass]タブで、[フィラメント]ツールをクリックします。堅牢性を高めるために、このプロトコルは半自動追跡に依存しています。[自動作成をスキップ]をクリックします。モジュール インターフェイスに [描画] タブが表示されます。ここでは、方法としてAutoPathを選択し、タイプとしてDendriteを選択し、推定された樹状突起の直径を入力します。
   3. ポインタの選択モードを使用して、カーソルをボックスに変えます。Shift キーを押しながら樹状突起の始点を右クリックします。注: ソフトウェアは初期計算を実行します。
   4. 樹状突起に沿ってポインタを移動します。始点(青い球で表される)から、最も可能性の高い樹状突起の経路を表す黄色の線が表示されます。Shift キーを押しながら樹状突起の端点をクリックします。
3. 自動スパインセグメンテーションを実行します。注:トレースされた樹状突起のスパインは、モジュールインターフェイスによって自動的に検出されます。
   1. モジュールインターフェイスで、[作成]タブをクリックします。[再構築]ドロップダウンリストで、[樹状突起直径の再構築]を選択し、[データの保持]ボックスをオンにします。次に、[再構築] をクリックします。
   セグメント
   2. 化されたボリュームが実際の樹状突起ボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして、距離マップから最短距離を選択します。[次へ] ボタンをクリックします。
   3. ソフトウェアの[スライス]タブの距離ツールを使用して、スパインヘッドの最小直径と最大長を決定し、[超える]タブに戻ってパラメータを入力します。このプロトコルでは、最小直径で約200〜300 nm、最大長で約4 μmの値が適切な出発点です。[ブランチ スパインを許可] ボックスをオンにしないでください。[次へ] ボタンをクリックします。
   4. [シード ポイントのしきい値]を調整して、スパインを表す青いポイントが実際のスパイン ヘッドにローカライズされるようにします。[次へ] ボタンをクリックします。注: コア計算は現在行われており、時間がかかる場合があります。
4. スパインを分類するには、モジュールインターフェイスの [ツール] タブに移動します。[スパインの分類] をクリックします。プロンプトが表示されたユーザーインターフェイスで、次のように形態によって定義される4つのクラスがあることを確認します。スタビー:長さ<1μm;きのこ:長さ(背骨)>3、最大幅(頭)>平均幅(首)x 2。長い細い:平均幅(頭)≥平均幅(首)。糸状偽肢様:長さ≤4μm(頭なし)。注: モジュール インターフェイスは、分類の結果を含む 4 つの新しいフィラメント オブジェクトを生成します。
5. 統計データのエクスポート: これら 4 つのオブジェクト インターフェイスのいずれかで、[統計] タブに移動します。[すべての統計をファイルにエクスポート] ボタンをクリックします。
   注: 樹状突起 (長さ、面積、平均直径、枝の深さ、分岐角度、体積など) とスパイン (真直度、付着面積、異なるスパイン部分の長さと体積など) のその他の統計値をエクスポートできます。 背骨の直径、密度など)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red	Gibco/ Life Technologies	14190169
Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent	Sigma Aldrich	P4957
マウスラミニン	Dutscher Dominique	354232
N2 サプリメント	Gibco/Life Technologies	17502048
B-27 サプリメント ビタミン A なし (50X)	Gibco/Life Technologies	12587010
DMEM/NUT。MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-メルカプトエタノール	Gibco/ Life Technologies	31350-010
ペン-ステップトマイシン	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP ウサギ血清ポリクローナル抗体	Gibco/ Lifeテクノロジーズ	A-6455
馬血清	Gibco/ライフ テクノロジー	16050130
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ	Gibco/ライフ テクノロジーズ	A11034
ポリクローナル抗ベータ III チューブリン抗体	ミリポア	AB9354
カバーグラス 13 mm	VWR	631-0150
プロロング ゴールド退色防止試薬 avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra、粘性液体シ	グマ Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
ヒト線維芽細胞	Coriell 細胞株バイオリポジトリ	GM 4603 および GM 1869	Coriell Institute for Medical Research、カムデン、ニュージャージー州、米国
共焦点レーザー走査顕微鏡	Zeiss (Germany)LSM	700
Imaris Software	Bitplane AG, Zurich	6.4.0 version	Filament TracerとImaris XTモジュールが必要です
Huygens Software	Huygens software, SVI, Netherlands	Pro version	オプション(デコンボリューションテスト用)

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