中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

要約

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS 治療の可能性をサポートします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 20% 塩酸リドカイン原液の調製

塩酸リ

1. ドカイン 2 g を量ります。5〜6 mLの滅菌水を加え、穏やかにボルテックスします。滅菌水で容量を10mLに増やします。
2. 1.2 原液を 0.2 ミクロンのフィルターでろ過します。ストック溶液を1.5 mLマイクロ遠心チューブあたり1 mLずつ分注し、シーリングフィルムで密封します。4°Cで保存してください。

2. 覚醒マウスにおける直接髄腔内 AAV 送達

1. 70% エタノールを含む滅菌ガーゼを使用して作業領域を拭き、必要な消耗品を準備します。
2. 滅菌200 μL微量遠心チューブに95 μLのrAAVrh10ストック溶液(5 x 10¹²ゲノムコピー/ mL)を加え、5 μLの20%塩酸リドカインストック溶液を加えて、100 μLのAAVrh.10 / 1%塩酸リドカインストック溶液を調製します。上下にピペッティングしてよく混ぜます。次に、ウイルス溶液を氷上(4°C)に保存します。
   注:マウスあたり8 μLが使用されます。
3. 注射用のAAV溶液でシリンジを準備する
   1. 25 μLハミルトンシリンジを27 G針で組み立て、針の面取りされた先端をシリンジの体積スケールに合わせます。
   2. ウイルス溶液の4 x 10¹⁰ゲノムコピーを含む8 μLをシリンジにそっと引き込みます。気泡を必ず取り除いてください。
4. マウスの準備
   注:この研究では、雄または雌のFVB / NJマウス(30〜70日齢)を使用しました。ボンネット内でIT注入を行いました。
   1. 70%エタノールでフード内の作業エリアを滅菌します。目覚めているマウス(オスまたはメス、生後30〜70日、体重13〜20 g)をフード内でうつ伏せの姿勢でベッドピースの上に置きます。上半身を滅菌ガーゼで覆い、マウスを落ち着かせ、噛まれないようにします。
   2. 片側に親指、反対側に人差し指/中指で骨盤帯を適切かつしっかりと握って動物を固定します。親指と人差し指で両側骨盤帯の間の皮膚をぴんと張った状態に保ちます。手のひらで動物の上半身をそっと押さえます。
   3. 両側骨盤帯の間の背中の毛皮を剃り、ヨウ化物ベースのスクラブと70%エタノールで皮膚表面を滅菌します。
く
5. も膜下腔内注射
   1. もう一方の手の親指または人差し指で両側骨盤帯の間の中間線に沿って椎間腔を感じ、爪でくぼみを押してL5-L6椎間腔を示します(注射部位を見つけます)。
   2. 尻尾の付け根をわずかにゆっくりと回転させて、背骨の正中線を示します。注射する前に、針の面取りを動物の頭に向かって調整します。
   3. 動物がしっかりと固定されていることを確認し、背骨の正中線に沿って針を揃えます。
   針
   4. をくぼみの交点に静かに垂直に(またはわずかに70〜80°傾けて)挿入し、シリンジを中央矢状面に保ちます。骨をつなぐときにゆっくりと角度を約30°に減らし、針を椎間腔に滑り込ませます。
      注:明らかな突然のテールフリックは、硬膜内腔への侵入に成功した兆候です。針が椎間腔に入ると、針先がしっかりとクランプされているように感じます。この研究で使用した 27 G 針は、マウスへの IT 送達には適していますが、ラットには適していません。
   5. ベクター溶液を注入します。タイマーを起動し、8 μLのベクター溶液を1 μL/4秒の速度で注入します。納品終了後約1分で針を保持します。漏れないように、針を軽く回転させて引き抜いてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FVB/NJ マウス	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of University of University of Gene Therapy Centerマサチューセッツ医科大学
25μL ハミルトン注射器/27-30g 針	GASTIGHT	1702
70% エタノール	WEN ZHI
ガーゼ	Wei AN	5171112	8cm*10cm*12cm