不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Summary

マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。

Abstract

Synaptoneurosomes（SNS）は、マウス脳皮質の均質化と分別の後に得られる。彼らは、小胞または皮質組織が均質化されたときに軸索末端からの脱却孤立端末が再シールされています。 SNはシナプス伝達の研究に有用になる前と後シナプスの特性を、保持する。彼らは神経シグナリングで使用されている分子機構を保持して取り込み、ストレージ、および神経伝達物質の放出が可能です。

アクティブなSNの生産と分離は、細胞毒性になるとSNの機械的損傷に起因する低活性につながる可能性の拡張、高密度のために遠心分離し、ろ過と遠心分離の方法を、必要とすることができるフィコール、のような問題に使用してマスコミのすることができます。しかし、SNを分離するために、不連続パーコール-ショ糖密度勾配の使用は、並進アクティブSNの良好な収率を生成するために迅速な方法を提供する。パーコール-ショ糖密度勾配法では、等張性の条件を採用して、迅速かつ穏やかであり少ないと短い遠心分離スピンを持っており、ペレット、SNSとは、機械的損傷を引き起こすことに遠心操作を避けることができます。

Protocol

1。準備^1月4日

1. で、2.5 Mのショ糖のスラリー50mLを、1Mトリス - 塩酸2.5mLを、pH7.5株式、および0.5 M EDTA 0.1 mLを混合してpH8.0のストックを勾配培地（GM）バッファーを500mLを準備ミリボリュームへのQ水。凍結溶液、分注して店を滅菌フィルタします。
2. ミリ- Q H _{2 O}で1 mM溶液を作ることによってテトロドトキシン（TTX）の1000倍の株式を準備TTXのアリコートを-20℃で保存することができます
3. ミリQ水に100mMトリス（pH7.5）で、中の5 mMののNa ₂ HPO _4、4mMのKH ₂ PO _4、40mMのNaHCO _3水溶液 、および800 mMのNaClを加えることにより10倍刺激のバッファを準備します。株式は、4℃で保存することができます
4. プレクール遠心分離機に4℃
5. Milli - Q水で2.5 Mのショ糖（2 mL）を1ボリュームにパーコール（18 mL）を9ボリュームを追加することにより、等張パーコール（SIP）のストック溶液を調製し、よく混ぜる。
6. GMのバッファへのSIPのそれぞれの金額を追加し、それぞれを混合することにより、3、10、15、および23％の勾配層を準備します。

7. P1000ギルソンPipetmanを使用してキャップでベックマンの遠心チューブに2ミリリットル23、15、10のそれぞれ、3％等張パーコール溶液をピペッティングにより、グラデーションのレイヤーを注ぐ。レイヤ間のインタフェースは、層のないミキシングと明確に識別できるはずです。使用前に少なくとも20分間、4℃で勾配を保管してください。同じ日の使用が推奨されていますが勾配は24時間まで保存することができます。 [経験の浅い研究室の担当者は、層のインタフェースの視覚化のためのisomoticパーコールソリューションに青色色素を加えることによって準備勾配を実践している可能性があります。]

2。マウスの解剖¹

1. すべてのマウスの飼育と安楽死の手順はNIHや大学のガイドラインに従って行われていることを確認します。二酸化炭素の窒息により又は動物のプロトコルでの承認された方法による仔（年齢P13へP21）を安楽死させる。
2. 解剖ボードにマウスを固定し、エタノールで首と頭の後ろをスプレー。頭蓋底で脊髄を切って切れるはさみを使用して、頭頂骨と頭頂間骨の間、または大脳と皮質領域間の横方向に頭蓋骨を切断、頭蓋骨の上から皮を取り除く。その後、ベースから鼻（矢状縫合に沿って）に頭蓋骨を切断、慎重側に各半球を引いて、ソフト頭頂骨を削除し、スパチュラで皮質を削除します。小脳上記の脳の中にヘラを挿入し、皮質をかき出すと、氷冷GMのバッファに置きます。均質化のステップに進んで。皮質はこれが悪影響をSNの形成に影響を与えるので非常に長いために、氷冷緩衝液中で座ってはいけない。

3。ホモジネートやSNS ^1-4の準備

1. 氷冷GMバッファに皮質をすすぎ、冷たいGMの緩衝液5 mLを含むガラスDounceホモジナイザーに2つの皮質を転送する。
2. 優しく緩み乳棒の5-10ストロークと皮質を均質化（乳棒"A"）、タイト乳棒（すりこぎ"B"）の5〜10ストロークで続いた。ストロークは、迅速かつ気泡が生じないように十分に遅くする必要があります。均質化後のホモジネートの写真は、 スキーム1になります。ストロークの数は、個々のホモジナイザーとそれに付随する乳棒に依存して変化します。勾配が強いSNのバンドを与える必要が終わったら、、ストロークの数を調整する場合ではない。
3. ペレット、細胞残渣および核に4で15 mLコニカルと10分間1000xgで遠心°スイングバケットローターでC（アレグラ6KR遠心分離機）にホモジネートを転送します。紡糸ホモジネートの写真は、スキーム1になります。
4. 4でパーコール-スクロース勾配、キャップチューブ、および5分間32500 × gで遠心当たり上澄みの層を2mL ·固定アングルローター、適切なアダプタを使用して（ベックマンJ2 - 21遠心、JA - 17ローター）（でC 試薬と機器表 ） を参照してください。
5. オフピペットとガラスパスツールピペットを用いてSNのバンド、上記の液を捨て。 23分の15％の界面でのSNのバンドからピペット、氷の上に円錐とストアに転送する。各勾配または1つの皮質は、SNの0.9から1.1 mLを生成します。
6. 12nmの最終濃度に1000倍のCaCl _2を追加し、非特異的な励起を抑制するために1μMの最終濃度を1 mMのTTXの株式を追加、10倍の刺激のバッファの十分の一のボリュームを追加することにより、SNの塩濃度を調整します。 （それが下流のSNのアプリケーションに干渉する場合CaCl ₂の添加は任意です）。
7. マイクロBCAタンパク質アッセイキットを用いてSNのタンパク質濃度を決定する。 （ブラッドフォードタンパク質アッセイは、理由パーコールからの推論では推奨されません。）
8. SNをはタンパク質並進のために直接かつ迅速に使用することができます。る研究。他のアプリケーションではSNライセートは、クリーンアップまたはピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて濃縮することができます。

4。代表的な結果：

マウス皮質が不連続パーコール-スクロース勾配（ スキーム1）、6つのバンドまたは分数で均質化し、分離されたとき（ 図1）が見られた。それは、以前は高分子量バンドの成分が膜とミエリンを破壊し、ペレット化材料が（ 表1）ミトコンドリアや細胞小器官が含まれていることされている大脳皮質^3,5ラットが示された。 23パーセント/ 15％インターフェース（バンド5）豊富なSNを含んでいた。

無傷のSNを含む23パーセント/ 15％インタフェース、、でのバンドは、前述した電子顕微鏡（EM）によって削除され、調べられた^{。2,6 -} EMはそのままシナプス小胞の存在とシナプス前及びシナプス後要素の保全（ 図を示した2）。プリとシナプス後コンパートメントの分離は、シグナリングおよび両方のコンパートメントで発生するタンパク質の合成を、調べるために重要です^。7-13パーコール-ショ糖密度勾配は、我々はSNの画分にマイナーな携帯電話、核とオルガネラの混入を見たように、原油精製ですが全体的な分離は良好であった。

ウェスタンブロット法によって調べたところ、パーコール分画は、SNのバンド（ 図3、表2）におけるシナプス純度の増加に伴って予想されるタンパク質マーカーが含まれていました。シナプスとニューロンのマーカーは、濃縮されたSNのバンド（バンド5）中で維持したが、他のマーカーの存在量が有意に減少した。構造とシナプスのマーカーが維持または強化された一方、特に、GFAP、グリア由来の星状膠細胞と腫瘍細胞のマーカー、およびラミン- B1、核マーカー、の存在は、無視できる程度であった。さらに、タンパク質合成の役割を果たすようなミトコンドリアとゴルジなどの細胞小器官、、のためのマーカーの保持があった。

BCAタンパク質アッセイによって決定されるSNのバンドのための典型的な収量は、μLあたりのタンパク質の250〜500 ngのでした。 SNを、50μMglutamate/10μMグリシンで刺激したときにSNの活性は、de novoのタンパク質合成量によって決定された[35S] - Metの取り込み（ 図4）によってモニターを提示²基礎翻訳活性は1.56倍に増加した（GLU）またはPin1の阻害剤のjugloneで活性化倍5.12。 Pin1の阻害は、[35S] - Metの取り込みの増加は、de novoのタンパク質合成のために行われたことを確認するために増加するタンパク質合成²に生じることが知られている、我々は、40μMのアニソマイシン、タンパク質合成阻害剤を追加し、そして定款の著しい減少を見た基底レベルと比較してGluの存在下および不在下インチまた、2％加えてSNの整合性を破壊するトリトン- X 100、によって、基底の変換は75％減少した^。2はさらに、ほとんどのシナプスマーカーの濃縮を示したバンド（B4 - B6）を調べるときに、 SNをまたはバンド5 は 、de novoタンパク質合成（ 図5）の最大の活性を有していた。このように、不連続パーコール-スクロース勾配は、迅速にタンパク質の翻訳を研究するために使用できる高活性と濃縮されたSNのバンドを生成する。

機械的損傷が過酷な条件によって引き起こされているため、不連続パーコール-ショ糖勾配の手順は、他の方法よりも有利である。皮質ホモジネートをクリアする濾過法、と比較するとサイズの減少は^、3,14-15パーコール法は、大きな活性をより多くのSNを形成する一連のフィルタを通過させる。としてろ過の方法によって調製されたSNのアリコートを23分の15％の界面ではるかに少ないSNSや壊れた膜のより多くの量が存在するパーコール-ショ糖勾配上を通過した図6に見られる。 de novoのタンパク質合成は、S35 - METの取り込みを経由して測定したところ、ろ過法により調製したSNは（ 図7）はるかに活動的であった。翻訳活性を最大化するために我々は、年齢P14とP18の間にあるマウスを使用してください。 SNは、成体マウスから調製、しかし我々は幼若マウス（ 図8）から調製したSNと大幅に増加翻訳活性を観察することができます。

表1。均質化したマウスの皮質の不連続パーコール勾配分画からのバンドの成分^。3,5

表2。不連続パーコール-ショ糖勾配のバンド成分の西部ボルトの分析の要約。バンドの画分のそれぞれの相対濃度のタンパク質は、不連続Percolを用いて単離されたL -糖勾配は、ウエスタンブロットによって測定した。なしに存在するタンパク質（ - ）、0≥0.2（+）、0.2≥0.8 (++),または> 0.8 (+++)倍のnの上清（S、大脳皮質ホモジネートを遠心分離）、代表的な中に存在​​するタンパク質より大きい= 3。

スキーム1：不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてSNの準備の模式マウスの脳の皮質は、解剖均質化、および非ホモジナイズした組織を削除するには、低速で遠心分離し、細胞が、そのような核や膜などの全体の小器官。。不連続勾配は、明確に定義された層を持つ必要があります。はめ込み画像は、レイヤーを視覚化するために、説明のみを目的として、青色染めされている層、の例を示しています。上清は、不連続パーコール-ショ糖勾配の上に重層し、中速で遠心分離する。 SNのバンドは、その後、勾配から取り出され、使用することが可能です。

図1。不連続パーコール-ショ糖密度勾配上でホモジネート分画 。マウス皮質が均質化し、6つのバンドや分数を生じさせる不連続パーコール-スクロース勾配で分離した。精製、アクティブなSNを（*）がバンド5で発見された。

図2。 SN製剤は、シナプス前及びシナプス後要素を保持するSNの混在を与える。C57BL / 6マウス（年齢P13へP21）から調製したSNの準備の電子顕微鏡写真は、前述のように実行すると、保存シナプス前及びシナプス後要素とSNを示していた^{。2 6}赤の矢印はシナプス後密度を指している。スケールバーは1μmである。

図3。 SN製剤のウエスタンブロット解析では、シナプスとニューロンのマーカーを精製SNS（バンド5）で維持されたが、他のマーカーの存在量が著しく減少したことを示した。上清の免疫ブロット（S、皮質ホモジネートを遠心分離）とバンド不連続1-6パーコール-スクロース勾配は、β-アクチン（構造、コントロールをロードする）、GFAP（星状）、GP73（ゴルジ）、HSC70（細胞質と核）、ラミン- B1（核）、Prohibitin（ミトコンドリア）、PSD95（シナプス後密度のためにプローブした）、SNAP25（シナプス）、シナプトフィジン（シナプス）とβ3-チューブリン（ニューロン特異的）。バンドは、n = 3の代表、ストーム860 Phosphorimagerを使用して可視化した。

図4。 SNはアクティブになっていて、[35S] - Metの取り込みを経由してde novoタンパク質合成を示す。SNは℃で10分間37に予め平衡化した。その後、SNは3740μmのアニソマイシンまたは1μMのjugloneで15分間未処理または前処理された° C ° CのプラスまたはマイナスのGlu - Metは、20μlのエクスプレスProのラベルS35簡単タグをミックス[35S]は、を加え、37℃で30分間。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。

図5。不連続パーコール-ショ糖勾配からバンド5は、de novoのタンパク質合成の最高レベルを含んでいた 。バンド4、5、6、上清を（S、皮質ホモジネートを遠心分離）℃で10分間〜37予め平衡化した。その後、[35S] - Metと、エクスプレスProのラベルミックスS35簡単タグは、追加、プラスまたは37マイナスのGlu℃で30分間した。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。

図6。ろ過法から調製したSNは不連続パーコール-ショ糖密度勾配法から調製したSNをより多くの壊れた膜と少なく、全体のSNが含まれています 。 SNを、以前説明したように細孔径を小さくすると、一連のフィルタを介して均質化した皮質を渡すことによって調製した。ろ過の方法によって調製されたSNの^3,14-15アリコートを、不連続パーコール-ショ糖勾配上の遠心分離と同等の量と比較した不連続パーコール-ショ糖密度勾配法を用いて材料の。

図7。ろ過法から調製したSNはSNはあちこちに用意さよりもde novoタンパク質合成活性が含まれていますメートル不連続パーコール-ショ糖勾配法。 SNを、以前説明したように減少し、孔径フィルター^、3,14-15の一連と不連続パーコール-ショ糖密度勾配法により均質化した皮質を渡すことによって調製した。両方の製剤からSNは37に予め平衡化された℃で10分間。その後、[35S] - Metと、エクスプレスProのラベルミックスS35簡単タグは、追加、プラスまたは37マイナスのGlu℃で30分間した。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。

図8。若いマウス（P14）からSNはそれ以上の年齢のマウス（P85）を超える翻訳活性を持っている。SNは37 preequilibrated、不連続パーコール-ショ糖密度勾配法を用いて別の老齢マウスから調製された区でGluに治療または未治療の10分、のためのCを[35S]の存在は、- Metは、スナップ凍結、30分間（エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス）と、後ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを使用してクリーンアップ。 SNをその後、12％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で実行乾燥し、n = 3、± SEMの分子動力学ストーム860 phosphorimager、代表的に画像化した。 P14マウスからのSNはP85マウスよりも少なくとも3倍以上の活性であった。

Discussion

ここに記載さ不連続パーコール-ショ糖勾配の準備は、シナプス伝達の実験の様々な使用することができるアクティブなSNを、分離するために迅速、信頼性の高い方法です。 Dunkleyら^、3,4によって開発された方法に基づいてこの勾配法は、互いに関連付けられている両方の前およびシナプス後膜由来の小胞を分離した細胞内脳分画の手順です。さらに精製することなくこれらのSNは免疫沈降、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、[35S]を経由して- Metの取り込み、電子顕微鏡、および酵素活性アッセイの様々なイソメラーゼを含む監視de novoのタンパク質合成を含む分子生物学的手法、さまざまな互換性がありますキナーゼ活性をアッセイ。

不連続パーコール-ショ糖勾配の手順は比較的簡単ですが、それは4でソリューションと脳の物質を維持するための鍵です° Cの準備を通して、プレチル勾配へ。ホモジネートはタンパク質分解を最小限に抑えるためにすべての回で、氷冷保存されているものの、大きな活性と優れた収量を得るためには、それはあまりにも長い間均質化する前皮質は、GM、バ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
マイクロBCAタンパク質アッセイキット	ピアース	23235
CaCl 2で	フィッシャー	C79 - 500
CO 2ガス	Airgasの（UW - MDS）	CD 50
EDTA	RPI	E57020
エタノール	フィッシャー	A407SK - 4
塩酸	フィッシャー	A142 - 212
パーコール	GEヘルスケア	17-0891-01
KH 2 PO 4	フィッシャー	P285 - 500
PierceSDS - PAGEサンプル前処理キッ​​ト	ピアース	89888
NaClの	RPI	S23020
NaHCO 3の	フィッシャー	BP328 - 500
のNa 2 PHO 4	フィッシャー	S381 - 500
スクロース	RPI	S24060
トリスベース	RPI	T60040
テトロドトキシン	シグマ	T5651
エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス	パーキンエルマー	NEG772
機器の	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
解剖ツール
ダウンスホモジナイザー、7 mLの（二枚のガラスに付属する"A"と"B"とラベルされた乳棒）	ホイートン
P1000ギルソンPipetman	ギルソン	F123602
アレグラ6KR遠心機	ベックマンコールター	366830
GH 3.8ロータ、スイングバケットローター	ベックマンコールター	360581
ベックマンJ2 - 21遠心	ベックマン
キャップ付きベックマンチューブ	ベックマン	355672
白壁のアダプタ	ベックマン	342327
青い壁のアダプター	ベックマン
JA - 17ローター、固定アングルローター	ベックマン	369691

抗体の名前	会社	カタログ番号	宿主動物種	希釈係数
β-アクチン	シグマ	A5441	マウスを	1:2000
GFAP	サンタクルス	SC - 65343	マウスを	1:200
GP73	サンタクルス	SC - 134509	ウサギ	1:200
HSC70	サンタクルス	SC - 7298	マウスを	1:200
Laminβ	サンタクルス	SC - 6261	ヤギ	1:200
Prohibitin	サンタクルス	SC - 28259	ウサギ	1:200
PSD95	ミリポア	MAB1596	マウスを	5μgの/μL
SNAP25	アブカム	ab5666 - 100	ウサギ	1:2000
シナプトフィジン	ミリポア	MAB368	マウスを	1:500
β- 3 -チューブリン	サンタクルス	SC - 80016	マウスを	1:200