培養アストロサイトにおける貨物の細胞内輸送の可視化

要約

出典: Creighton, BA, et al. アストロサイトにおける細胞小器官と他の貨物の細胞内輸送の視覚化と解析J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオは、酸性エンドリソソーム小胞を選択的に標識する蛍光アシドトロピックプローブを使用した培養アストロサイトにおける細胞内貨物輸送の視覚化を示しています。共焦点顕微鏡によるタイムラプスイメージングとZスタック取得により、3次元細胞体積全体で蛍光標識された貨物を追跡できます。この分析により、静止貨物と細胞周辺または核に向かって移動する貨物が区別され、細胞内輸送動態についての洞察が得られます。

プロトコル

1.蛍光タグ付きプラスミドのトランスフェクショントランスフェ

クション

1. または標識の前日に、トランスフェクション後24〜48時間にイメージングするために所望の密度でアストロサイトをシードします。24ウェルプレートまたは14 mmガラス底ウェルの推奨密度は、2 x 104細胞/ウェルです。
   注:このプロトコルは、リフフェクションベースの方法を使用して、24ウェルプレートまたは14 mmガラス底ウェル上の12 mmガラスカバーガラスにプレーティングされたアストロサイトのトランスフェクションに最適化されています。試薬は、星状細胞が増殖している培養皿のサイズに応じてスケーリングする必要があります。
2. リポフェクション試薬(材料表)を還元血清培地(材料表)で希釈します。リポフェクション試薬とDNAの比率を最適化するには、適切な希釈液の範囲をテストします。例えば、このプロトコル(材料表)で使用されている試薬を使用する場合は、2、3、4、および5 μLのリポフェクション試薬を50 μLの還元血清培地で希釈します。
3. 5 μgの高純度DNAを250 μLの還元血清培地で希釈します。5 μLのリポフェクションエンハンサー試薬(材料表)を加えます。リポフェクション試薬を含むチューブを、同量のDNA-リポフェクションエンハンサーミックスと混ぜ合わせます。ピペッティングで混合し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
4. アストロサイト培養培地を除去し、トランスフェクションミックス(ステップ1.3)を細胞に滴下します。37°Cおよび5%CO2で6時間インキュベートした後、トランスフェクション複合体を適切な量のアストロサイト培地(14 mmガラス底皿の場合は2 mL)に置き換えます。画像取得に進む前に、さらに24〜72時間インキュベートします。インキュベーションステップの期間を注意深く監視して、タンパク質発現と細胞生存率の最適なバランスを実現します。

2.蛍光プローブを使用した後期エンドソーム/リソソームの標識

注

:一部のカーゴは、カーゴ特異的タンパク質に対して高い親和性を持つ蛍光色素を使用して標識できます。次の例では、蛍光アシドトロピックプローブによる後期エンドソーム/リソソームの標識を許可します。

1. リソソーム標識プローブ( 材料表)を200 μLのアストロサイト培地で1 μMの作業濃度に希釈し、ステップ1.1のアストロサイトに2 x 104細胞/ウェルの密度で塗布します。37°Cで30分間インキュベートします。
2. 温かいアストロサイト培地で細胞を一度洗浄し、イメージング培地と交換します( 材料表)。すぐにライブイメージングに進みます。

3.タイムラプスイメージングシステムを使用した画像取得

注:タイムラプスライブイメージングは、高速カメラ、明確フォーカス、インキュベーションチャンバー、および高開口数の40倍オイル対物レンズ(例:Plan-Apochromat 1.4NA)を備えた蛍光顕微鏡を使用して行う必要があります。タイムラプスイメージングには、さまざまな取得ソフトウェアが利用可能です。顕微鏡システムと取得ソフトウェアの選択は、それらの可用性と特定の研究の目標への適合性に基づいて行う必要があります。一般的なガイドラインをいくつか以下に示します。

1. 培養チャンバーまたは培養皿を顕微鏡ステージの適切なアダプターに入れます。落射蛍光を使用して、蛍光タンパク質を発現する細胞またはプローブを選択して記録します。蛍光サンプルの照明を調整して、デジタルカメラを使用して選択した細胞を視覚化します。光退色や光毒性を引き起こす可能性のある高照度の使用は避けてください。フォーカスとズームを調整します。
2. ズームおよび明確フォーカス機能を使用して、300秒から500秒の範囲の時間間隔で、2秒ごとに1フレームの周波数で単一のZスタックタイムラプスシリーズを取得します。
   注:トラフィックダイナミクス(速度、運動周波数など)は目的のタンパク質によって異なるため、取得の時間経過の調整が必要になる場合があります。たとえば、ミトコンドリアはリソソームよりも運動性が低く、頻繁に休止を示します。この場合、取得パラメータを 1 秒ごとに 5 フレーム、800 秒に調整する方が適切です。
3. タイムラプス画像を保存し、AVIまたはTIFFスタックファイルとしてエクスポートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dulbecco's modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Ubine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	バージョン1.52i
先端ピンセット	F.S.T	11254-20	スタイル #5
蛍光光源	エクセリタス	012-63000	X-Cite 120Q
ガラス底皿	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm 皿 |No. 1.5 カバースリップ |ガラス径 14 mm |コーティングされていない
Graefe 鉗子	FST	11054-10	先端が湾曲した Graefe 虹彩鉗子
酸性コンパートメント (後期エンドソームおよびリソソーム) を染色する緑色蛍光色素 Life	Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26.DMSOSに1mMの原液に予め溶解します。選択した増殖培地または緩衝液で最終作業濃度まで希釈します。
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	マグネシウムおよびカルシウムフリー
イメージング メディア	ライフ テクノロジー	A14291DJ	ライブ セル イメージング ソリューション
立共焦点顕微鏡	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX試薬
オービタル振とうインキュベーター	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 、温度と速度制御を備えたオービタル振とうインキュベーター
ペニシリン/ストレポマイシン溶液 (100x)	Gen Clone	25-512
リン酸緩衝生理食塩水 (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Tris buffer、pH 8.5、1mg/mL で溶解します。長期保存のために冷凍してください。凍結と解凍のサイクルを避ける
元血清培地	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
組織培養フラスコ	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2。100%角度の付いたネックアクセス、0.22um疎水性ベントフィルターキャップ
組織培養インキュベーター	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i、温度、湿度、CO2制御
付き組織培養インキュベーターTris-Base	Sigma	T1503	8.402 gを4.829 gのTris HClを含む水に1リットルに溶解して0.1 M Tris緩衝液、pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 gを8.402 gのTris Baseを含む水に1リットルに溶解して0.1 M Tris緩衝液、pH 8.5

倒 還