マウス脳切片における血液脳関門の高解像度3次元共焦点イメージング

要約

出典: Villaseñor、R、Collin。L. 血液脳関門の高解像度共焦点イメージング: トランスサイトーシスのイメージング、3D 再構成、および定量化。J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオは、共焦点顕微鏡を使用した血液脳関門(BBB)の高解像度3Dイメージングを示し、抗体染色マウスの脳切片を示してBBB成分と細胞内構造を分析し、脳の恒常性、神経血管相互作用、および疾患関連のBBB機能障害の研究に適用できます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 血液脳関門の高解像度共焦点イメージング
2. 光スペクトルの青、緑、オレンジ、および赤領域の蛍光色素を励起するために、405、488、561、および633 nmのレーザーラインを使用して、適切なレーザー走査型共焦点顕微鏡( 材料表を参照)で画像取得を行います。画像取得には、開口数が1.4の63倍オイル対物レンズを使用します。
3. 顕微鏡を制御するソフトウェアの取得メニューで、画像取得パラメータを設定します。[画像サイズ] のドロップダウン メニューで、1024 x 1024 ピクセルの値を選択します。「ズーム」メニューの値を調整して、ピクセルサイズを200〜300 nmの値に変更します。」
   注:細胞内構造の分析では、ピクセルサイズを75 nmに減らします。この画像サイズ設定により、取得時間が大幅に増加し、512 x 512ピクセルに縮小して、より小さな視野で撮影することで取得時間を短縮できます。
[
4. 取得速度]ドロップダウンメニューで、400Hz、つまり毎秒400ラインの値を選択します。 「システム設定」メニューで、「ピクセル深度」ドロップダウンメニューを選択し、値を12ビットに変更します。
5. 顕微鏡ソフトウェアの「取得」タブ内で、シーケンシャルフレーム取得のオプションをオンに切り替えます。「ピンホール」メニューの値を変更して、各チャンネルの光学断面の厚さを0.75〜1μmの値に設定します。
6. 蛍光励起用のパネルで、サンプル中の蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザー(たとえば、緑色発光蛍光色素用の488 nmレーザーライン)を活性化します。
   注:蛍光色素スペクトルビューア( 材料表を参照)を使用して、適切な励起レーザーを選択します。
7. 蛍光検出のパネルで、スライダーを動かして、各チャネルで測定される波長を選択します(たとえば、緑色を発する蛍光色素の場合は510〜550 nmの間)。
   注:蛍光色素スペクトルビューア( 材料表を参照)を使用して、適切な検出波長を選択します。
8. ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率を一致させるために、脳セクションのカバーガラスの上に屈折率1.52の浸漬油を一滴加えます。サンプルを顕微鏡に入れ、落射蛍光灯をオンにして、顕微鏡双眼鏡を使用してサンプルを視覚化します。
9. 顕微鏡スタンドのボタンを使用して、フィルターホイールを変更し、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)染色核の視覚化に適したフィルターを選択します。粗い焦点を使用して、DAPIで染色された核からの信号に焦点を合わせます。
10. 顕微鏡スタンドのボタンを使用して、フィルターを変更して血管マーカー(CollagenIVやCD31など)からの信号を視覚化し、個々の毛細血管セグメントの視野を中央に配置します。
11. ボタンを押して、ライブスキャンモードを開始します。スキャン中は、各チャンネルのゲインとレーザー強度を調整して、画像のダイナミックレンジを最大化し、ピクセルの飽和を回避します。
    注:飽和ピクセルにラベルを付けるルックアップテーブルを使用して、過飽和を視覚的に評価します。シグナルの過飽和を避けるために、蛍光シグナルが最も高いと予想されるサンプルで設定を調整します。
12. ライン平均化の値を 2.
    に設定します。注: より高い取得速度を使用する場合は、ノイズを減らすためにこの値を大きくしてください。
13. キャピラリーの体積全体にまたがる光学 Z スタックを実行するための開始セクションと終了セクションを確立します。0.45 μm.
    のステップサイズを使用してください注:その後の定量に画像を使用する場合は、完全なデータセットに対して同じ取得設定を維持してください。
14. 定量化のために、統計的比較のために、少なくとも3つの異なるマウスからセクションごとに10〜20のzスタックを取得します。
    注:サンプルの漂白とレーザー強度の変動から生じる変動を減らすために、同じセッションで完全なデータセットを取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Novus Biologicals MCA2388 Labels		に対するラットモノクローナル抗体クローンER-MP12	釈1:100で使用するロバのポリクローナル抗ラットIgG(H+L)と適切なAlexaFluor色素を組み合わせて検出し、希釈1:400
で使用ポドカリキシンに対するラットモノクローナル抗体	R&D Systems	MAB1556	ラベル 毛細血管の内腔希釈 1:100 で使用ロバポリクローナル抗ラット IgG (H+L) と適切な AlexaFluor 色素を組み合わせて検出し、希釈 1:400 で使用
Biotrend	BT21-5014-70 に対するウ	サギポリクローナル抗体	ラベル 毛細血管の基底膜希釈1:100で使用ロバポリクローナル抗ウサギIgG(H+L)と適切なAlexaFluor色素を組み合わせて検出し、希釈1:400で使用
R&D Systems	AF2335	に対するヤギポリクローナル抗体	細胞にラベルを付ける希釈1:100で使用するロバポリクローナル抗ヤギIgG(H+L)と適切なAlexaFluor色素を組み合わせて検出し、希釈1:400
で使用Cy3 Abcam ab49874 に結合した GFAP に対するマウスモノクローナル抗体クローン G-A-5			ストロサイト 希釈 1:100 で使用
Iba-1 に対するウサギポリクローナル抗体	Wako	019-19741	標識 ミクログリア 希釈 1:100 で使用 ロバポリクローナル抗ラット IgG (H+L) と適切な AlexaFluor 色素を結合して検出し、希釈 1:400 で使用
ラットモノクローナル抗体 ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	ラベル リソソーム希釈 1:100で使用 ロバポリクローナル抗ラットIgG(H + L)と適切なAlexaFluor色素を組み合わせて検出、希釈1:400 マウス
IgGに対するロバポリクローナル抗体(H + L) AlexaFluor594 LifeTechnologies		A21203	希釈1:400で使用
マウスIgG(H + L)に対するロバポリクローナル抗体 AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	釈1:400
で使用マウスIgGに対するヤギポリクローナル抗体(H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	希釈1:400で使用
光封入剤	Dako	S3023	Dako蛍光封入剤
レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステム	NA	カ TCS SP8 X HyD検出器付き白色光レーザー
処理ソフトウェア	ライカマイクロシステム	ズ NA	Leica Application Suite AF バージョン 3.1.0 ビルド 8587
画像解析ソフトウェア	ビットプレーン科学ソフトウェア	NA	Imaris バージョン 7.6.5 ビルド 31770 x64
蛍光スペクトルビューア	サーモフィッシャー サイエンティフィック	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

CD31/PECAM Brain Endothelial Cells希コラーゲン IV CD13 周 ア 希 蛍ズ ライ画像 用