マウスモデルにおける網膜色素上皮へのウイルスベクターの網膜下注射

要約

出典: Park, SW, et al.マウス網膜色素上皮における遺伝子治療のためのウイルスベクタの輪部アプローチ‐網膜下注射J. Vis. 経験。(2015年)

この

ビデオでは、マウスモデルで網膜色素上皮(RPE)にウイルスベクターを網膜下注射する方法を説明しています。麻酔と眼の準備から正確なレンチウイルスベクター送達までの手順が詳細に説明されており、RPE での遺伝子の統合と発現が保証されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 注射キットとウイルスベクターの準備

1. エチレンオキシドガスを使用して滅菌した 33 G の鈍い針を備えたマイクロリットルのシリンジを準備します。ウイルスベクターをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈して、マイクロチューブ内の適切な力価(すなわち、1 x 10⁶ TU/μl)にします。シリンジをウイルスベクターで数回洗い流し、シリンジ内のデッドスペースを取り除きます。

2.ウイルスベクターの網膜下注射

ティ

1. レタミンとゾラゼパム(1:1、2.25 mg / kg体重)および塩酸キシラジン(0.7 mg / kg体重)の混合物の腹腔内注射または代替の適切な麻酔レジメンで成体マウス(すなわち、6〜8週間齢)を麻酔します。
2. フェニレフリン0.5%とトロピカミド0.5%の点眼薬で瞳孔を拡張します。
3. マイクロリットルシリンジに1.5〜2μlのウイルスベクターをロードして調製します。
4. まぶたを開き、目を突き出して赤道を露出させ、注射に便利です。手術顕微鏡下でそれに焦点を当ててください。注射が終了するまで突き出た目の位置を維持すると、注射中に針がずれる可能性があります。眼球をしっかりと保持するには、指を眼窩縁の外側に置きます。
5. 眼科用粘弾性溶液を角膜表面に一滴塗布します。
6. 角膜の上部に小さな丸いカバースライドを置き、網膜を視覚化します。
さらに
7. 網膜下注射のために、滅菌された30 G 1/2針を使用して輪部のわずかに後方に小さな穴を開けます。便宜上、右目は下、左目は上に穴を開けてください。
   注:側頭や鼻に穴が開いていると、注射後にまぶたで覆われにくくなります。最初の穿刺は、輪部に沿って走り、簡単に認識できる輪部血管を避けるために、輪部の少し後方に行う必要があります。最初の穿刺中にレンズに針が当たらないように注意してください。レンズのパンクを避けるために、針のベベル全体を挿入しないでください。
8. マイクロリットル注射器の33 G鈍い針を事前に穴を開けた穴に通し、軽度の抵抗が感じられるまで網膜下腔に針に近づきます。
   注:網膜下注射の場合、針の最適なアプローチ角度は虹彩面に対して約45度であり、鈍い針は乳頭周囲領域に向かって後方に押す必要があります。点線の四角形は、図1の網膜下注射のために硝子体腔を横切る推奨針経路を示しています。
   注:網膜層は非常に柔らかいため、網膜層に穴を開ける(または通過する)ときに抵抗は感じられません。したがって、軽度の抵抗の最初の感覚は、針がすでにRPE(網膜色素上皮)層に触れていることを示しており、針の挿入を停止する必要があります。針は潜在的な網膜下腔に配置する必要があるため、過度の圧力で強膜組織を貫通しないように注意してください。針が過度の力で強膜組織に穴を開けると、抵抗なく外眼窩腔に入ります。(このステップは重要です)
9. ウイルスベクター(例:1 x 10⁶ TU/μl)を震えずに網膜下腔に穏やかに注入し、望ましくない組織損傷を防ぎます。次に、針をそっと引き抜きます。2.4で説明されているように、注射中は眼球をしっかりと保持します。
注射
10. 後の網膜下水疱の形成を手術顕微鏡で観察し、網膜出血がないことを確認します。

結果

図 1.網膜下注射の模式図。H&E(ヘマトキシリンおよびエオシン染色)染色されたマウスの眼の断面は、網膜下注射用の針経路がマークされた構造を描いています(点線の正方形)。倍率:40倍、スケールバー:500μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ピンセット DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm チップ	WPI	500233
VANNAS はさみ S/S、105mm	WPI	555583S
33G 鈍針	WPI	NF33BL-2
NanoFilシリンジ、10マイクロリットル	WPI	NANOFIL
RPE-KIT	WPI	RPE-KIT	片手で簡単に注射できる
30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM ニードル	BD	305107	網膜下注射用初期穿刺
顕微鏡カバーグラス (No. 1 直径3mm)	ワーナーインスツルメンツ	64-0720 (CS-3R)
ライカ操作顕微鏡	ライカ	LM M80
フルオレセセイン顕微鏡	ニコン	クリプス80i
レンチウイルス	サーモサイエンティフィ	TMO。LV-CTR	ベクターの希釈に使用
PBS	Gibco	10010-015	ベクターの希釈に使用
トロペリン (フェニレフリン 0.5%-トロピカミ 0.5%)	ミ		拡張用
プロパラカイン塩酸塩点眼液 USP、0.5% (滅菌)	Bausch&Lomb		局所麻酔用
Healon GV OVD	Abbott Medical Optics Inc.
ゾレチル 50 (次塩酸チルタミンおよび次亜塩酸ゾラゼパム)	Virbac		全身麻酔用
ロンプン®注射 (キシラジン HCl)	バイエル		全身麻酔用

エック ハン