$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.テトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩(TMRE)によるローディングセル
注
:このプロトコルでは、TMREは20 nMの最終濃度で非クエンチモードで使用されます。一般に、選択した顕微鏡で十分な信号強度を提供する可能な限り低い濃度のTMREを使用する必要があります。蒸発が不均一であるため、異なるウェル内の培地の量は、長期初代培養で異なる可能性があります。すべてのウェルで一貫したTMRE濃度を確保するために、TMREをウェルに直接添加しないでください。代わりに、各ウェルの培地を同量のTMRE含有培地に置き換えます。以下のプロトコルは、ウェルあたり~1 mLの培地を含む24ウェルプレート内の初代ニューロン用に設計されています。
- 組織培養層流フードで作業し、各ウェルから500 μLの培地を1つの円錐形チューブに収集します。
- ウェルごとに、0.5 μLの20 μM TMREストックをコニカルチューブに加えます(例:24ウェルで12 μL)。
- 最初のウェルから残りの培地を慎重に吸引し、500 μLのTMRE含有培地と交換します。残りのウェルをウェルごとに続けます。
注:細胞を乾燥させたり、細胞を乱したりしないように注意してください。 - 細胞をインキュベーターに戻し、色素平衡化まで少なくとも60分間待ちます。
注:負荷時間は、悪影響なしに数時間に延長できます。 - イメージング実験全体を通じて一貫したTMRE濃度と平衡化を確保するには、イメージングバッファーとすべての刺激溶液に20 nM TMREの最終濃度を必ず含めてください。
2. 走査型共焦点顕微鏡設定の最適化
注
:このステップは、ライブイメージング中の画質と細胞生存率の間の最良の妥協点を見つけることを目的としています。このセクションでは、還元酸化感受性緑色蛍光タンパク質(roGFP)イメージングの設定の最適化について説明します。マルチパラメトリックイメージングを実行する場合は、漂白や光毒性の兆候のない安定したベースラインのチェックなど、追加の指標に対して同様の最適化を実行する必要があります。
- 共焦点顕微鏡を起動し、GFPイメージングの標準設定(励起488 nm、発光505 - 550 nm)をロードします。
- 検出器を12ビットまたは16ビットに設定します。手記：通常、定量イメージングには8ビットでは不十分です。
- シーケンシャルスキャンモードをアクティブにし、2番目のシーケンス/トラック(405 nm励起、505 - 550 nm発光)を追加します。
- どちらのチャンネルでも、露出オーバーピクセルと露出不足ピクセルを示す擬似色ルックアップテーブル(GLOW OUなど)を選択します。
- 目的の対象物に適した対物レンズを選択してください。
注:10x-40xは単一細胞分析に適しており、63x-100xは単一ミトコンドリア分析に適しています。 - 細胞の入ったカバーガラスをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファーを加えて、チャンバーを顕微鏡に置きます。
- 接眼レンズと透過光を使用して、細胞の焦点を合わせます。
注:落射蛍光を使用して細胞を特定して焦点を合わせないでください。低電力でも、これはセルに悪影響を及ぼします。 - さまざまなピクセル形式で画像を記録します。これらの画像に基づいて、目的の構造の許容可能な解像度を与える最小のピクセル数を選択します。
注:通常、512 x 512ピクセルは20倍および40倍の対物レンズを使用したシングルセルイメージングに適しており、1024 x 1024または2048 x2048ピクセルは通常、63倍の対物レンズを使用した単一ミトコンドリアイメージングに適しています。 - さまざまなピンホールサイズで画像を記録します。これらの画像に基づいて、対象の構造の許容可能な解像度を提供する最大のピンホールサイズを選択します。
注:通常、3〜7個のエアリーユニットがうまく機能します。 - 異なるレーザー強度で画像を記録します。
- 検出器のゲインとしきい値を適宜調整します。これらの画像に基づいて、許容可能な信号強度と信号対バックグラウンド比を提供する最も低いレーザー強度を選択します。
- 信号対バックグラウンド比を決定するには、細胞またはミトコンドリアを含む関心領域 (ROI) と、細胞またはミトコンドリアのない ROI (ROI2) の信号強度を測定します。次に、ROI1の強度をROI2.
注:1〜3%のレーザー出力で405nm>励起では>3の信号対バックグラウンド比と200〜1,000の個々のROIの信号強度、1%のレーザー出力で488nm励起では300〜1,500の個々のROIの強度を目指します。
- スキャン速度やフレーム平均数の異なる画像を記録します。設定の組み合わせごとに4〜5枚の画像を記録します。これらの画像シリーズに基づいて、許容可能な画像ノイズと画像間の変動を与える最高速度と最低平均設定を選択します。
注:ほとんどの場合、600 Hzのスキャン速度と平均化用の1〜2フレームがうまく機能します。 - 新しいカバーガラスを使用して、最適化された設定でタイムラプスシリーズを記録します。
注:シリーズの期間と画像間隔は、計画された実験の期間と画像間隔に似ている必要があります。 - タイムラプスシリーズの最後に、1 mLの2xジアミド(DA)溶液を記録チャンバーに加えます。さらに2分間の画像。
- 蠕動ポンプまたはハンドヘルドピペットを使用してイメージングバッファーを吸引します。1 mLの1xジチオスレイトール(DTT)溶液を加えます。さらに5分間の画像。
- タイムラプス実験を解析します。
- 最適化された設定で DA および DTT 処理中に 2 つのチャネルのいずれも露出オーバーまたは露出不足にならないことを確認します。
- タイムラプス録画中に、2つのチャンネルのいずれもかなりの漂白が見られないようにします。最初の画像と最後の画像の間で強度が<2%低下することを目指します。
- イメージング中に 405:488 の比率が大きく変化しないことを確認します。
一貫して- 許容可能な結果を提供する設定が定義されるまで、いくつかのカバーガラスを使用して、手順全体を繰り返します。
3. 基礎酸化還元状態の評価
顕
- 微鏡を起動し、セクション 2 から最適化された設定をロードします。
- フレーム平均を 3-5 に設定します。
- 細胞の入ったカバーガラスをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファーを加えて、チャンバーを顕微鏡に置きます。
- 接眼レンズと透過光を使用して、細胞の焦点を合わせます。
注:落射蛍光を使用して細胞を特定して焦点を合わせないでください。低電力でも、これはセルに悪影響を及ぼします。 - スキャンモードに切り替え、ライブビューで488 nmチャンネルを使用して、イメージング用の細胞に焦点を合わせて位置を特定します。
- マルチポイント機能を使用して、カバーガラス上の3〜5つの視野を選択します。
- ベースライン画像を記録します。
- 1 mLの2x DA溶液をチャンバーに加えます。
- 1、2、3分後、ライブビューを使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
注:細胞は通常、2分後に完全に酸化されます。 - イメージングチャンバー内のバッファーを1 mLの1x DTT溶液と交換します。
- 3分と5分後、ライブビューを使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
注:セルは通常、4〜5分後に完全に縮小されます。
4.急性期治療のライブイメージング注
:以下のプロトコルは、NMDA治療に対するミトコンドリア酸化還元応答のイメージングについて説明しています。実験の画像間隔と期間は、他の処理のために調整する必要がある場合があります。
- 顕微鏡を起動し、セクション3から最適化された設定をロードします。
- タイムラプス間隔を30秒、期間を25分に設定します。
- 細胞の入ったカバーガラスをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファーを加え、チャンバーを顕微鏡上に置きます。
注:熱焦点ドリフトを避けるために、タイムラプスイメージングを開始する前に、細胞を顕微鏡ステージに10〜15分間放置してください。 - 接眼レンズと透過光を使用して、細胞の焦点を合わせます。
注:落射蛍光を使用して細胞を特定して焦点を合わせないでください。低電力でも、これはセルに悪影響を及ぼします。 - スキャンモードに切り替え、ライブビューで488 nmチャンネルを使用して、イメージング用の細胞に焦点を合わせて位置を特定します。
- オプション: 実行ごとに記録されるセルの数を増やすには、マルチポイント機能を使用して、カバーガラスごとに 2-3 の視野を画像化します。
- タイムラプス取得を開始し、5枚の画像を2分間のベースライン記録として記録します。
- 500 μLの3x NMDA溶液をチャンバー(最終濃度30 μM)に加え、10分間のNMDA応答としてさらに20枚の画像を記録します。
注:ニューロンは浸透圧の変化に非常に敏感です。したがって、イメージングバッファーの蒸発を最小限に抑えるようにしてください。長時間の治療の場合は、イメージングチャンバーを蓋で覆う必要があります。 - 500 μL の 4x DA 溶液をチャンバーに加え、さらに 6 枚の画像を記録します (最大キャリブレーション 3 分
)。- イメージングチャンバーからバッファーを吸引し、1 mLの1x DTT溶液と交換します。さらに10枚の画像を記録します(最小5分間のキャリブレーション)。
- 録画を終了し、画像シリーズを保存します。