石英マイクロニードルを使用したげっ歯類脳マイクロインジェクション

要約

出典: Paolone, G., et al.げっ歯類脳におけるマイクロインジェクションのための個別化針J. Vis. 経験。(2018)。

このビデオでは、穴の開いた石英マイクロニードルを使用したげっ歯類の脳マイクロニードル注入のデモンストレーションです。マイクロニードルは、送達速度を制御するためにシリンジとマイクロポンプに取り付けられています。注射液の入った針を、送達速度を低く設定して脳に挿入します。配置されると、配送速度が向上します。針は短い間停止した後に引き抜かれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.石英針の調製

1. 石英毛細管( 材料表を参照)を蒸留水に5分間、エタノール99%に5分間、ジエチルエーテルに5分間入れて洗浄および滅菌します。
2. 毛細血管をボンネットの下に少なくとも1時間放置して、完全に乾かします。
3. 個々のニーズに応じて、十分に長く、十分に細い針を製造できるパラメータに従って、レーザープーラーを使用して針を準備します。
   注:レーザープーラーを使用しています( 材料表を参照)。引っ張るには2行のプログラムを使用します。最初のラインは、高出力、最大のスキャン長(FILAMENT'S VALUEに対応)、引っ張り力を使用しません。このパラメータの組み合わせにより、最も低い伸長速度で毛細管の大部分が溶融し、内側/外側のサイズが大きく、シャンクが小さくなった長い針の成形が可能になります。このようにして、針は高い機械的抵抗と広い内径を維持し、幹細胞やウイルス粒子を目詰まらせることなく通過させることができます。このプログラムラインの速度と遅延は、先端が小さく長くなりすぎて、必要な機械的および形状特性が欠けていなくなる前に、毛細管の伸長を停止する必要があります。引っ張りプログラムの2行目は、石英が冷えると自動的に実行されます(5秒)。パワー、フィラメント、引っ張り力のパラメータは、チップの長さが可能な限り短く、シャンクが急なチップを切断し、チップの破裂による2本の針の分離を回避するために機能します。私たちの機器では、日常的に以下を使用します:(a)ライン1 =パワー990、フィラメント5、速度130、遅延110、プル0。(b) ライン 2 = 電力 970、フィラメント 3、速度 0、遅延 70、プル 0。
針
4. を70%エタノールで洗浄したシャーレに入れます。
   1. 皿をプラスチックパラフィンフィルムで覆います。
5. マイクロディセクタで毛細血管を切断します。
   1. 起動時に、レーザーに自動校正プロセスを実行させて、供給される電力とエネルギーを確認します。次に、切断パラメータを設定します。
      注:マイクロディセクタ( 材料表を参照)と次のパラメータを使用します:レーザー出力パルスエネルギー(63 μJ)、最大開口部の20%のレーザービーム直径(最大開口部:1.0 μm)、および最大速度の10%の切断速度(最大速度:30 μm / s)。
   2. 針を顕微鏡テーブルにしっかりと固定し、その先端をコンピューター画面の中央に置きます。
   3. メニューバーで鉛筆アイコンをクリックし、それを使用して針のレーザー切断のマークを描きます。
      注:カットは針の表面に対して約45°の角度にする必要があります。
   4. サイドバー機能で、「START CUT」ボタンを含むフラグを選択して、レーザーが以前にマークしたスポットを切断できるようにします。
   5. 必要に応じて、1.5.2-3で説明した手順を繰り返して、サイドホールを切ります。針の位置を変更する必要はありません(図1)。
6. カット後のクリーニング。
   1. プラスチックチューブを通してニードルをボイドポンプに接続します。
   2. ポンプの電源を入れ、順方向の流量を適度な速度(3 μL/分)に手動で設定します。
   3. 最初に99%エタノールを吸引し、次に蒸留水を吸引して、切断による不純物を除去します。
   4. 乾燥を容易にするために、99%エタノールを再度吸引します。
      注:各ステップは少なくとも3分間続く必要があります。
7. 手術当日まで、適切に覆われたシャーレに針を保管してください。
8. 針は再利用できます。実験の最後に、漂白剤とエタノールで洗浄して、溶液と組織の残留物を除去します。より完全な洗浄を行うには、先端が下を向くようにマイクロピペット保存ジャーに針を入れ、先端が覆われるまで瓶に蒸留水を入れ、1.5分間沸騰させて残った組織を取り除き、エタノールで洗浄します。

2. 手順

1. ポンプのユーザーマニュアルに記載されている指示に従って、設定メニューを選択してマイクロインジェクションシリンジの直径/容量に応じてポンプを校正し、流量を 0.3 μL/分に設定します。
2. 鈍い針(ハミルトン針、30 Gなど)と短いポリテトラフルオロエチレンチューブを備えた10 mLシリンジに滅菌水を入れ、マイクロインジェクションシリンジ(ピストンを非常に慎重に取り外した後)と手動マイクロインジェクションポンプ(MMP)用の注入アセンブリ部品キットに充填します。
   注:MMPキットは、針を定位フレームにしっかりと取り付けるために使用されます(図2).キットには、ポリテトラフルオロエチレンチューブ、ルアー-チューブカプラー、ピペットホルダー、および外径の異なるピペット用のガスケットが含まれています。
3. 針をMMPキットに接続します。
   1. 10 mL シリンジでシステム全体にさらに水を洗い流し、針から水が出てくるかどうかを確認します。
      注: 充填手順を繰り返して、システム内の気泡を必ず取り除いてください。
4. マイクロインジェクションシリンジの上部に水滴を残すためにピストンをゆっくりと押しながら、10mLシリンジをマイクロインジェクションシリンジから外します。マイクロインジェクションシリンジにピストンを挿入します。
5. マイクロインジェクションシリンジをポンプに接続し、流量を0.3 μL /分に設定します。
   注:針の先端から液滴が漏れるまで待ってから、さらに3分間放置します。
6. 流量を0.1 μL/minに設定し、手術手順を開始します。手術中はポンプが作動しているはずです。
   注:この記事で報告されている実験では、300 g(生後3か月)の雄スプレイグドーリーラットを使用します。ただし、この手順は他の種、特にマウスに適用できます。
7. 地域の規制で承認された方法を使用して全身麻酔を誘発します。
   注: 85 mg/kg ケタミンと 8 mg/kg キシラジンの腹腔内注射 (ip) を 20-50 分間麻酔します。動物が完全に鎮静されていることを確認するために、尾やつま先をつまむことが重要です。麻酔のレベルと基本的なバイタルは、手術開始前に評価され、手術中は 10 分ごとに監視されます。動物の体温は、水再循環加熱パッドを使用して、外科手術の前、最中、後に一定に保たれます。動物は完全に回復するまで監視されます(たとえば、直立して歩行可能になります)。さらに、動物は鎮痛薬(トラマドール、5〜7 mg / kg ip.p.)を術後24時間ごとに3日間投与されます。
   1. 動物の頭を剃り、無菌手術のために手術部位を適切に準備します。ヨウ素ベースの溶液(ベタジン)と70%エタノールで2段階のスクラブを実行します。さらに、無菌を維持するために、手術部位を手術用ドレープで包みます(ビデオではデモンストレーションのため省略しています)。
ラ
8. ットを定位固定フレームに置き、水再循環加熱ブランケットの上に置きます。追加の痛みを和らげるために、手術部位に0.5%リドカイン溶液を塗布します(7 mg / kgを超えないでください)。ビーズ滅菌器または液体冷消毒を使用して、機器を2%グルタルアルデヒドと7.05%フェノール(スポロディシンまたはシデックス)に浸し、その後滅菌水または生理食塩水ですすいで、すべての手術器具を事前に滅菌します。消毒は、手順の合間でも実行する必要があります。滅菌メスを使用して頭蓋骨を縦方向に切り込みます。過度の出血を避けるために優しくしてください。平らなヘラを使用して頭皮を開き、皮膚のフラップに外科用クリップを当てて開いた状態に保ちます。非常に穏やかに、骨膜を剥がして、前骨と針が挿入される頭蓋骨の領域を露出させます。
9. アームを定位固定フレームに取り付け(流れが進行している間)、針の先端をブレグマの真上に動かし、先端を壊さないように注意します。ブレグマの前後座標と中外側座標に注釈を付け、目的の座標に変換します。実体顕微鏡に導かれて、針の先端が頭蓋骨にほぼ触れるまで針を下げ、定位固定腕を少し上げた後、穴あけスポットに印を付けます。
10. ドリル(ドリル先端Ø:0.8 mm、ドリル速度:1,000 rpm)マークされた場所に頭蓋骨をドリルします。穴あけ手順中に硬膜を貫通しないように注意する必要があります。穴あけ中は、骨の損傷や壊死を避けるために滅菌生理食塩水を点滴してください。
11. プラスチックパラフィンフィルムの小片を切り取り、頭蓋骨の上に置きます。10 μLのピペットを使用して、溶液を一滴垂らしてプラスチックパラフィンフィルムに注入します。ポンプを停止し、ポンプのプッシャーを少し回収し、マイクロインジェクションシリンジのピストンをそっと引っ張って毛細管内に小さな気泡を作ります。
12. 針の先端がドロップに達するまで定位アームを下げます。マイクロインジェクションシリンジのピストンを(非常にゆっくりと)引っ張ってサンプルを抽出し、気泡の形成を避けます。ピストンに接触しているポンププッシャーを交換し、0.3 μL/minの流量でポンプをオンにします。次のステップに進む前に、液滴が形成されるまで(数分)待ちます。
    注:現在の例の実験では、人工脳脊髄液(aCSF)を線条体に注入しました[AP(前後):+1.5、ML(内外側):±2.7;DV(背腹側):-5.0]および背側海馬(AP:-3.5、ML:±2.1;日差:-3.5;硬膜からmm単位)、2 μL/部位。2 つの注射方法の比較を容易にするために、一方の半球に石英針を使用し、もう一方の半球に 26 G の鈍い先端または 30 G の斜角先端のステンレス鋼針を使用して、各脳領域を注入しました。
13. 流量を0.1 μL / minに下げ、ステンレス鋼の斜角針で硬膜にニックを付け、背腹軸の定位アームをゆっくりと下げて脳組織に入ります。目的の位置に達したら、さらに0.1 mm下がり、ポンプを停止し、定位アームを0.1 mm上げて、0.3 μL / minの流量でポンプを再起動します。
    注:針を下げながらゆっくりとした流れを維持する理由は、針自体の組織の小さな破片の浸透を避ける陽圧を確保するためです。このようなイベントは先端を妨げ、溶液の送達を損ないます。針を下げるときの流量は非常に遅く、下げる速度は約10 s/mmであるため、これは、針の跡に沿って残る溶液の量が、ターゲット部位に注入された溶液と比較して無視できることを意味します。この注意事項は、側面に穴のある針を使用する場合は避けることができます。
14. タイマーを開始し、注入する量に応じて必要な時間待ちます(たとえば、2 μLを注入する場合は6分40秒)。注入中の気泡の動きを監視します。最後に、ポンプを停止し、5分間待ってからゆっくりと針を取り出します。石英針が完全に抽出されたら、ポンプを再度始動し、針の先端に液滴が形成されていないか確認します。
頭
15. 蓋骨表面の開口部を骨ワックスで密閉し、止血クリップを取り外して頭皮を縫合し、傷の周囲を抗生物質クリーム(ネオスポリンなど)でコーティングし、動物をホームケージに戻します。

結果

図1:液体の注入に使用される先端と穴の異なる直径を示す石英針先端の顕微鏡画像。(A)の低倍率画像と(B)と(C)の高倍率。針は、(B)および(C)に示すように、脳領域の解剖学的構造、拡散目標、および溶液の粘度に応じて、さまざまな方法(異なる長さ、穴番号、および穴の寸法)で調製できます。低出力レーザー顕微解剖を使用して得られた穴と先端の滑らかな切断に注目してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
石英毛細管	Sutter Instruments、Novato、CA USA	Q100-50-10	フィラメントなし
ーラー	Sutter	P2000
マイクロピペット保存ジャー	World Precision Instruments (WPI)、米国フロリダ州サラソタ	E210
レーザーマイクロディセクタ	ライカ マイクロシステムズ、ウェッツラー、ドイツ	LMD6500
ハミルトンシリンジ	ハミルトン ILS Innovative Labor Systeme GmbH、ザンクトッツァーバッハ、ドイツ	19138-U
マイクロインフュージョンポンプ	Univentor、Zejtun、マルタ	モデル 864
手動マイクロインジェクションポンプキット	WPI	マイクロピペットを定位フレームにしっかりと取り付けることができる	MMP-KIT
精密ドリル	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	変速ボールベアリングドライブシャフト
脊髄液	Tocris	3525
針 26 G 鈍いおよび 30 G ベベル	ハミルトン	26 G 鈍い: 19138-U30 G ベベル: 20757

プアイテム#: キット 可人工脳