共焦点顕微鏡を用いた免疫標識星状細胞の三次元イメージング

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 動物、手術、および標本の準備注

: 3 次元 (3D) 共焦点顕微鏡分析用に脳組織を準備します。

1. 動物をランダムに2つのグループに分けます:アミロイドベータ(Aβ)_1-40\u2012注射(n = 8)、およびゲニステイン治療によるAβ_1-40\u2012注射(n = 8)。手術の1時間前に、ゲニステイン(ポリエトキシル化ヒマシ油などのビヒクルで希釈した10 mg / kg)を強制経口投与します。
2. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)で動物を麻酔します。つま先をつまんだ後の離脱反射の欠如により、適切な麻酔を確認します。乾燥を防ぐために、手術中は目に軟膏を使用してください。
3. 動物を定位固定装置に入れ、頭を剃ります。切開前にヨウ素溶液を塗布して頭皮をきれいにし、手術中は手術部位を無菌状態に保ち、感染のリスクを軽減します。ラット脳アトラスによると、Aβ_1〜40を、ブレグマの後方-3.5 mm、正中線の外側±2 mm、硬膜の-2.8 mm下の海馬に立体定位的に(4 μl)注入します。
4. 動物が完全に意識が回復するまで術後の観察/ケアを提供し、動物の快適さを確保します。回復中は動物を暖かく保ち、完全に回復するまで他の動物と一緒にケージに戻さないでください。手術後の動物の感染の兆候に注意してください。
5. 手術の3週間後にケタミン(150 mg / kg)で動物を深く麻酔します。動物を0.9%生理食塩水で灌流し、続いて0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水またはPBS(pH = 7.4)で4%パラホルムアルデヒドを灌流し、脳を除去して固定することにより、経心固定を行います。
6. 脳を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで2〜3日間ポスト固定します。
7. 組織包埋装置を使用してパラフィンブロックに組織を埋め込み、正しいアライメントや切片化を妨げる可能性があるため、カセットの充填不足または過剰充填は避けてください。パラフィンブロック内の組織の向きに注意してください。
   注:たとえば、ラットの海馬は大脳半球の後部に近いです。したがって、組織は、切片が脳の後部から始まる方法で埋め込まれる必要があります。Paxinos アトラスをガイドとして使用して、目的の解剖学的構造に到達します。
8. 空気の動きにより切片の取り扱いが困難になるため、ミクロトームを空気のドラフトや出入り口から離して配置してください。
この
9. 深さは完全な星状細胞のZスタック画像を生成するために必要になるため、厚さ≥20μmの切片を使用してください。最初の2つのセクションは、熱膨張により望ましくない厚さになる可能性があるため、使用しないでください。
セクション
10. を温水(5±2°C、パラフィンの融解温度より低い)の表面に、セクションを平らにするのに十分な長さに置きます。
    注:セクションが過度に膨張すると、構造の形態が乱れる可能性があります。小さな絵筆を使用して、セクションを慎重に転写します。各スライドに2〜3つのセクションを集めます。
11. スライドを直立したラックに保管し、37°Cで数時間または一晩(O/N)乾燥させます。

2. 免疫組織化学

1. 切片をキシレンで 2 x 10 分脱パラフィンし、アルコール勾配 (99.8%、95%、70%、各 10 分) と PBS で再水和します。
2. 0.25%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.25%Triton X-100、および3.5%正常血清(4°CでO/N)を含むPBSで1:1,500に希釈したグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)に対する抗体とインキュベートします。
3. 切片をPBSで3 x 5分間洗浄します。
4. 二次アルカリリン酸結合抗体と1時間インキュベートします(1:100、21°C、PBSで希釈)。
5. PBSで切片を3 x 5分間洗浄します
   注:バックグラウンド染色を最小限に抑えるために、二次抗体の後に切片を適切に洗浄することが重要です。
切
6. 片を液体永久赤色発色剤(15〜20分)で暗闇でインキュベートします。
   注:使用の30分以内に溶液を調製してください。
7. 切片をPBSで3 x 5分間洗浄します。
8. 最後に、カバースリップの前に、4-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;1:500、PBSで希釈)で核を染色します。顕微鏡検査の前に、スライドを冷蔵庫に24〜48時間保管します。

3.共焦点顕微鏡注

:定量的評価(下記参照)では、エラーのリスクを減らすために、重なり合う枝が最小限に抑えられたDAPI染色核がはっきりと見える星状細胞を選択します。Z-Stack画像の作成には時間がかかります。辛抱強く、処理中に停止しないでください。正立共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、星状細胞の3D画像を作成します。

1. スライドを顕微鏡ステージに置き、63X対物レンズを選択します。
2. イメージングソフトウェアを開き、[システムの開始]をクリックします。[検索] タブをクリックします。[割り当て] に移動し、[GFP] を選択して適切なライトを調整します。
3. シャッターを開いて光を反射します。シャッターの右側にあるリフレクターリボルバーを見つけて、アストロサイトによって反射される色(緑、赤、または紫)を選択します。ここでは赤色(FSet20 wf)を使用しました。
   注:顕微鏡の接眼鏡で画像に直接焦点を合わせることを忘れないでください。
4. 最適な焦点を見つけるには、[すべて閉じている]をクリックし、顕微鏡ピンをスクリーンモードにして、[取得]タブをクリックします。
5. [Acquisition]タブの[Smart Setup]をクリックすると、ウィンドウが開きます。リストから適切な蛍光色素(現在のプロジェクトではDAPIとAlexa Fluor 555など)を選択します。色が自動的に選択されます。
[
6. Best Signal]と[Apply]をクリックし、[Set Exposure]をクリックします。その後、コンピューターは自動的に露出パラメータを設定します。
7. 画像を最適化するには、[チャネル]ウィンドウに移動します。Track2のマークを解除し、Track1を強調表示して、[Live]をクリックします。必要に応じて画像に焦点を合わせます。
8. [チャンネル]ウィンドウで、次のキーを調整します。[1AU]をクリックすると、ピンホールが自動的に最適化されます。このステップを実行することは非常に重要ですが、そうしないと共焦点画像が最適ではありません。ゲインを調整して、最適な強度にします(余分なノイズを減らすには、この設定を800未満に保ちます)。最後に、デジタルゲインを2から3の間に設定します。
9. Track1のマークを解除し、Track2をクリックして、Track2に対して手順3.8を繰り返します。次に、ライブを停止します。
[
10. Acquisition Mode]ウィンドウに移動します。フレームサイズと平均化を最適化して画像を改善します。フレームサイズを変更するには、X * Yに移動し、1,024 x 1,024を選択します。より良い画像を作成するには、遅い速度を選択します。
平均
11. 化に移動し、数値 ≥4 を選択します。この平均値は、取得した画像を生成するために平均化されるスキャン数を示します。次に、 スナップ ボタンをクリックして、キャプチャした 2D 画像を保存します。
12. 3Dイメージングの場合は、[スマートセットアップ]の下のZ-Stack項目をマークして、Z-Stackウィンドウを開きます。
13. Zスタックの最初と最後の位置、つまりセルの深さを設定します。まず、ライブをクリックします。次に、顕微鏡のフォーカスドライブを使用して、Zスタックが開始される組織内の星状細胞の最上部位置に焦点を合わせます。[最初に設定]をクリックします。次に、組織内の星状細胞の最も低い位置に焦点を合わせ、そこでZ-Stackスキャンを停止します。[最後に設定]をクリックします。次に、ライブを停止します。
14. 間隔を選択します。現在のスタディでは1.01 μmが使用されます。間隔を選択するには、[最適]をクリックしてスライス数を設定します。
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15. 実験の開始」をクリックします。スキャンが完了したら、画像を保存します。この画像は、次のパラメーターの測定に使用されます:アストロサイト領域の表面積と体積、ならびに枝、細胞体、および核を含むアストロサイト全体。