リポソーム複合体を用いたプリオンタンパク質サイレンシングのためのニューロンへの標的siRNA送達

要約

出典: Bender, HR, et.al.カチオン性および陰イオン性リポソームを用いた中枢神経系への治療用siRNAの送達J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオでは、リポソームsiRNA-ペプチド複合体(LSPC)を使用して、プリオンタンパク質(PrP)siRNAをニューロンに標的に送達する方法を示します。カチオン性リポソームは、PrPを標的とするsiRNAに静電的に結合し、血液脳関門を介した受容体を介した輸送のためにRVG-9rペプチドによってさらに安定化されます。脳内に入ると、LSPC はニューロンでエンドサイトーシスを受け、siRNA を放出して RNA 干渉を開始し、PrP 発現を減少させ、プリオン病の進行を阻止します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. LSPCの調製

1. LSPCの1:1のDOTAP(1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン):コレステロール比を使用します。4 nmoleのリポソーム調製物の場合、2 nmoleのDOTAPと2 nmoleのコレステロールをフラスコ内の10 mlの1:1クロロホルム:メタノール溶液に混合します。
ヒ
2. ュームフード内でN₂ガスを使用してクロロホルム:メタノール溶液9mlを蒸発させます。最後の1mlの溶媒をガスなしでヒュームフードで一晩蒸発させます。フラスコの底に薄い脂質膜があるのを観察します。
3. 10%スクロース溶液10mlを55°Cに加熱します。
4. 加熱した10%スクロース溶液を、フラスコを穏やかに回転させながら、薄い脂質膜にゆっくりと、つまり1 ml / minで注ぎます。脂質分子がゲル液相にとどまるように、脂質を含む10%スクロースと脂質のフラスコを55°Cに維持します。再水和により、多層小胞 (MLV) が形成されます。
5. リポソームのサイズを決定する前に、脂質を55°Cで少なくとも1時間再水和させます。
6. メーカーの指示に従って押出機を1.0 μmフィルターで組み立てるか、サイジングに1.0 μmのシリンジフィルターを使用します。
7. 加熱したリポソーム懸濁液1mlを押出機のシリンジの1つに加え、2つのシリンジの間に懸濁液を11回通過させます。11回のパス後、サスペンションが開始シリンジとは反対側のシリンジにあることを確認してください。
8. リポソームのサイズを0.45 μm、次に0.2 μmのフィルターで再度サイズ調整して、大きな単層小胞(LUV)を生成します。サイジングを容易にするために、リポソーム懸濁液を加熱したままにしてください。
9. 20 μlの4 nmoleリポソーム懸濁液(200 μM)を200 μLの20 μM(合計4 nmole)ストックsiRNA溶液と室温で10分間インキュベートします。
10. 80 μlの500 μM(合計40 nmole)ストックRVG-9r溶液をsiRNA/リポソーム溶液とともにRTで10分間インキュベートします。LSPCはできるだけ早く使用する必要がありますが、調製後数時間まで使用できます。LSPCは、調製後、4°Cで数時間保存します。

2. マウスにLSPCを注射する

マウス

1. をヒートランプに5〜10分間さらして、血管系を拡張します。
2. 注射の5〜10分前および注射中に、2〜3%イソフルオラン/酸素流量でマウスを麻酔します。動物が歩行できなくなり、呼吸が遅くなったら、つま先をつまんで麻酔を確認します。マウスを仰臥または横向きに置いて、尾静脈にアクセスします。マウスの目に獣医軟膏を使用して、麻酔下での乾燥を防ぎます。
3. 尾部を70%EtOHで拭き取り/スプレーし、26 Gインスリン注射器を使用して300 μlのLSPCをマウスの尾静脈に注入します。尾静脈への遠位への注入を開始し、静脈が崩壊または破裂した場合は近位に移動します。
4. マウスが胸骨の横臥位を維持するまで、マウスを清潔なケージに入れます。マウスが完全に回復するまで、マウスを他のケージメイトと一緒に置かないでください。マウスは5〜15分で回復するはずです。回復に時間がかかる場合は、温熱パッドやヒートランプの下に置いて体温を維持できます。マウスは過熱を防ぐために注意深く監視する必要があります。
5. 注射後数時間動物を監視して、麻酔が切れ、治療による悪影響がないことを確認します。LSPC を少なくとも 24 時間循環させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
コレステロール	Avanti Lipids	700000
クロロホルム	Fisher Scientific AC268320010
メタノール	EMD Millipore	113351
N₂ ガス	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
押出機	Avanti Lipids	610023
1.0、0.4、0.2 μm フィルター	Avanti Lipids	610010、610007、610006