神経治療応用のための遺伝子組み換え間葉系幹細胞の特性評価

要約

出典: Sharma, AD, et.al.神経保護戦略のための治療因子の送達のために改変された成体幹細胞のハイスループット特性化J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオは、治療用神経栄養因子を発現するように操作されたトランスジェニック間葉系幹細胞を特徴付けるプロセスを示しています。細胞増殖マーカーを標的とする一次抗体と二次抗体で細胞を固定、透過化、染色し、その後、ハイコンテントスクリーニングシステムを使用して核内の蛍光シグナルを捕捉する分析を行う手順を概説します。増殖マーカー発現の増加は、トランスジェニック細胞の神経治療への応用への適合性を確認します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. Ki67 細胞増殖アッセイ

1. Ki67 細胞増殖アッセイ (免疫細胞化学)
   1. 細胞培養物を 0.1 M リン酸塩 (PO₄) バッファーで 1 分間 2 回すすぎます。培養物を室温で20分間4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。PFAを取り除き、ウェルをPBSで7分間3回すすぎます。
   2. 最終すすぎ後、100 μlのブロッカー溶液(リン酸緩衝生理食塩水、5%正常ロバ血清、0.4%ウシアルブミン血清、および0.2%Triton X-100)を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。一次抗体であるウサギ抗Ki67をブロッカー溶液で1:200の作業比で希釈することにより調製します。
   3. ブロッカー溶液を取り出し、100 μlの一次抗体溶液を各ウェルに適用します。96ウェルプレートを覆い、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 翌日、抗体溶液を取り出し、PBSで7分間、3回すすいでください。
   5. 二次抗体であるロバ抗ウサギCy3をブロッキング溶液中で1:500の作業比で調製します。DAPI核染色を二次抗体溶液に1:100の希釈で添加します。最後のPBSリンスを除去した後、100 μlの二次抗体/ DAPI溶液を各ウェルに適用します。室温で暗所で90分間インキュベートします。
   6. 二次抗体/DAPI溶液を除去し、各ウェルをPBSで7分間、3回すすぎます。96ウェルプレートを覆い、イメージングまで4°Cで保存します。

2. 自動イメージングと多波長スコアリング解析

1. 96ウェルプレート(Ki67免疫標識用に処理済み)をHCSシステムにロードし、プレートを20分間平衡化させます。HCSシステムの画像取得および分析ソフトウェアを開きます。
2. 10倍対物レンズの取得設定は、カメラビニングを1に、ゲイン設定を2にして選択します。自動露光機能を利用してセルが存在するZ面を見つけ、対象の各波長のオフセットを計算します。この解析では、DAPI(W1)、Cy3(W2)の画像をキャプチャします。ネガティブコントロールウェルが画像取得のシグナルを示さない最大強度レベルを選択します。この設定がポジティブウェルに適切であることを確認します。
3. プレートを取得します。画像をキャプチャし、画像取得および解析ソフトウェアのデータベースに保存します。
4. 画像を取得したら、オフラインで画像取得および解析ソフトウェアを開き、上記で取得した画像からプレートデータを確認します。
5. [多波長スコアリング分析]を選択します。各波長の最小強度と最大強度を設定します。
   注:DAPI検出は、目に見える各核の周囲の染色をマークする必要があります。Cy3は、Ki67免疫反応性(IR)で陽性細胞を検出する必要があり、陰性対照ではIRを検出しないでください。Cy3 Ki67 IRの場合、おおよその最小幅は7 μm、おおよその最大幅は30 μm、局所バックグラウンドより上の強度は150グレーレベル、最小染色面積は50 μm²でした。
6. すべてのポジションの分析を実行します。データをエクスポートしてスプレッドシートで表示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	Greiner Bio One	655090	ImageXpressで使用するために選択された96ウェルプレート
シ血清アルブミン(BSA)	Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)	A9647
サギ抗Ki67抗体	Abcam(マサチューセッツ州ケンブリッジ)	Ab16667	1:200 希釈
DAPI	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	D3571
ロバ抗ウサギ Cy3	Jackson Immuno Res Lab (ペンシルベニア州ウェストグローブ)	711-165-152	1:500 希釈
体 C57BL/6 マウスのマウス MSC	治療のためのチューレーン セント (ルイジアナ州ニューオーリンズ)		骨髄から単離
組み換え MSC (GFP、BDNF、GDNF、BDNF/GDNF)	これらの細胞は、以前の研究から得られました: Ye et al. (準備中)
正常ロバ血清 (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (ペンシルベニア州ウェストグローブ)	017-000-121
パラホルムアルデヒド (PFA)	Fisher Scientific (ニューハンプトン州)	O4042	0.1M PO4 バッファー中の 4% PFA
酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)	P4417
Triton X-100	Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)	X100
ImageXpress マイクロ	分子デバイス (カリフォルニア州サニーベール)	ImageXpress micro	ハイコンテントスクリーニングシステム
MetaXpress 4.0	分子デバイス (カリフォルニア州サニーベール)	MetaXpress 4.0	画像取得および解析ソフトウェア
KH₂PO₄	Fisher Scientific (ニューハンプトン州)	P285	PO₄バッファー用
K₂HPO₄	Fisher Scientific(ニューハンプトン州)	P288	PO₄バッファー用

ウウ 成 遺伝子 遺伝子 リン