低侵襲切除システムを用いたマウスの脳腫瘍切除

要約

出典: Alomari, S., et al.高生存率組織採取のためのげっ歯類における低侵襲脳腫瘍切除の実施J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオでは、腫瘍を移植した麻酔マウスから腫瘍組織を切除するための低侵襲切除システム (MIRS) の使用を示します。この手順には、マウスを定位フレームに固定し、以前の手術部位を再開して脳にアクセスし、吸引と回転ブレードを利用して腫瘍切片を除去する特殊なカニューレを挿入することが含まれます。切除後、切除された組織は滅菌チューブを通して収集され、回復できるように創傷が閉じられます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 最初の頭蓋内腫瘍移植

1. 研究の初期段階では、以前に発表された報告に従って、4 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (1x PBS) に懸濁された 100,000 個の細胞 (GL261 マウス神経膠腫細胞株) を各マウスに頭蓋内注射します。
2. 腫瘍移植の9日後に、in vivoイメージングシステムを使用して各マウスの腫瘍シグナルを定量化します。
   注:必要に応じて、腫瘍量に基づいてマウスを2つのグループに層別化します。本研究では、2つのグループは、(1)腫瘍量が比較的小さいマウス(平均生物発光シグナル= 5.5e + 006 ± 0.1e + 006光子/ s、n = 10)および(2)腫瘍量が比較的大きいマウス(平均生物発光シグナル= 1.69e + 007 ± 0.2e + 007光子/s、n = 10)、(p < 0.05、マンホイットニー検定)。
3. 各グループを2つの同等のサブグループに分けます。
   >注:この研究では、2つのサブグループは、未治療のマウス(n = 5)と、MIRSを使用して外科的切除を受ける腫瘍を有するマウス(n = 5)、(p > 0.05、マンホイットニー検定)。
4. 切除の日から始めて、腫瘍の増殖パターンに基づく頻度でin vivoイメージングシステムを使用して腫瘍の進行を追跡します。
   注:GL261細胞株の場合、切除当日に腫瘍の進行を追跡し、その後3〜6日ごとに

追跡します。

2. MIRS を使用した腫瘍切除

誘導

1. チャンバー内のイソフルラン-O₂ 混合ガスを使用してマウスを麻酔するか、キシラジン/ケタミン溶液を腹腔内注射します。
   1. ガス麻酔薬を使用する場合は、麻酔導入のためにガス流量を1.0 mL / minに、気化器を2.0%に設定し、通常、チャンバー内で3〜5分かかります( 材料表を参照)。
   2. 注射可能な麻酔薬を使用する場合は、0.2 mLの麻酔液(80〜100 mg / kgのケタミンおよび10〜12.5 mg / kgのキシラジン、 材料表を参照)を腹腔内に注射することによりマウスを麻酔します。
2. つま先をつまんで動物の適切な鎮静を評価します。角膜の乾燥を避けるために、眼科用軟膏を目に塗ります。処置前に鎮痛剤(0.03〜0.06 mg/kgのブプレノルフィンを皮下投与)を投与します。
3. 完全な鎮静が確認されたら、マウスを定位フレーム( 材料表を参照)に置きます。
   注:ガス麻酔薬を使用する場合は、マウスの鼻をノーズコーンに入れ、処置中にイソフルラン-O₂混合物を受け取り続けます(1.5%)。
4. 前のステープルを取り除き、脱毛クリームまたは髭剃りで髪を取り除きます。クロルヘキシジン/ベタジンベースのスクラブとアルコールを交互に繰り返して皮膚を消毒します。次に、滅菌メスを使用して、前の手術痕に沿って 1 cm の縦方向の正中線切開を作成します。
5. MIRS ハンドピースをステージ アダプター/ハンドピース ホルダーを介して定位アームに取り付けると、安定性と精度が向上します。
6. 次の設定を使用して、MIRSマシンをセットアップします( 材料表を参照)。
   1. 背面パネルにセットされている電源コードを電源コードレセプタクルに挿入します。システムの電源を切り替えてオンまたはオフにします(1 = ON、0 = OFF)。
   2. 窒素ホース(コンソールに付属)の一端をコンソールの背面パネルのオスフィッティングに挿入します。接続ナットを時計回りに回して、接続を締めます。
      注意: ホースの反対側の端を窒素供給に接続する必要があります。
   3. ホースを窒素供給装置に取り付ける前に、供給圧力がコンソールに推奨される入力供給圧力である100 psigを超えていないことを確認してください。
      注意: 窒素がコンソールに供給されると、フットペダルによって作動すると、コンソールは独自の吸引を生成します。
   4. 真空ポートの蓋を固定し、真空システム内の漏れを防ぐために密封します。吸引システムに漏れがあると、MIRS コンソールのパフォーマンスに影響します。
   5. セットアップまたはプライミング中に吸引が17未満の場合は、コンソール前面の吸引ノブが最大レベル(100)に設定されていることを確認し、吸引システムに漏れがないことを確認し、窒素入力供給圧力が正しいことを確認してください。
   6. フットペダルをコンソールに接続するには、グレーのフットペダルコネクタをグレーのレセプタクルにカチッと音がして所定の位置に収まるまで挿入します。
      メモ: フットペダルコネクタはコンソールに一方向で接続され、キーが付けられています。
   7. ハンドピースをコンソールに接続するには、青色のハンドピースコネクターを青色のレセプタクルに挿入し、カチッと音がして所定の位置に収まります。
      メモ: ハンドピースコネクタはコンソールに一方向で接続され、キーが付けられています。
   8. システムを使用する前に、滅菌液を小さなボウルから開口部に吸引し、チューブとハンドピースを通ってキャニスターに吸引し、チューブとハンドピースの内部が潤滑され、組織の閉塞が減少するようにすることで、各ハンドピースをプライミングします。
   9. コンソールのフロントパネルで適切なモードを選択して、単独の吸引または切断を伴う吸引に備えます。フットペダルを使用して開始します。
7. 23 G MIRSカニューレをバリ穴に2.5 mmの深さまで挿入します。
8. カニューレに接続されているフットペダルを踏んで切除プロセスを開始します。ハンドピースのコントロールノブを使用して、1サイクル(360°)以上の切除を実行します。
   注:実行されるサイクルが多いほど、切除される腫瘍組織の量が多くなります。
9. 切除プロセスが完了したら、23 G MIRS カニューレをバー穴から引き抜き、5 mL の 1x PBS を使用してチューブを洗い流し、残留破片を取り除きます。
10. 定位フレームからマウスを取り外し、ホッチキスまたは4-0縫合材料で創傷を閉じます( 材料表を参照)。
マウス
11. をケージに戻す前に、麻酔からの回復中にマウスを加熱パッドまたは暖かい光の下に置きます。
12. 実験が完了したら、フラッシングでカニューレをパージします。冷やした培地と空気を交互に使用して、切除されたすべての組織を収集キャニスターに「押し戻す」。収集キャニスターをシステムから取り外し、付属のキャップでキャップを外します。
13. ステップ2.12を完了した後、カニューレの遠位先端を3%H₂O₂に入れ、24〜25 in Hgで吸引を加えて吸引ラインを吸引収集キャニスターに戻し、60〜90秒間放置します。滅菌媒体で空気と媒体を断続的にパルスします。
14. 処置後の神経学的徴候(異常な不規則な動きまたは発作)がないかマウスを監視します。

結果

図1:MIRSシステムのセットアップ。(A)組織が統合されたげっ歯類モデルにおける脳腫瘍に対する低侵襲切除システム(MIRS)保存システム。(B) MIRS コンソールのフロント パネル。1 = システム電源、2 = フットペダル、3 = プライムボタン、4 = 吸引、5 = 吸引レベルコントロールダイヤル、6 = 吸引レベルインジケーター、7 = ハンドピース、8 = カッターイネーブルボタン。(

材料