ラットにおける熱痛反応に対する鎮痛薬の頭蓋内および腹腔内送達の相乗効果

要約

出典: Martinez, E., et al.げっ歯類における頭蓋内薬物療法と疼痛アッセイJ. Vis. 経験。(2019)。

このビデオは、前頭前野に事前に埋め込まれたガイドカニューレを使用して、麻酔をかけたラットに鎮痛薬を頭蓋内投与する方法を示しています。追加の鎮痛薬が腹腔内に同時投与されます。回復後、ラットの熱痛反応はハーグリーブ装置を使用して評価され、そこでは足の引き抜き潜時が測定され、投与された薬物の鎮痛効果が評価されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.定位固定カニューレ移植10

1. 〜12週齢の雄のSprague-Dawleyラットを使用します。
2. 1.5〜2%イソフルランで動物を麻酔します。動物が鋭利な鉗子で強くつまむことに反応しなくなったら、手術を行います。損傷を防ぐために、必ずすべての器具をオートクレーブし、滅菌手術用手袋を使用し、動物の目に眼科用軟膏を塗布してください。
3. 両側 26 ゲージ ガイド カニューレを前後方 (AP) の座標で 12.5 度の角度で前頭前野 (PFC) に定位的に埋め込みます: +2.9 mm、中外側 (ML): +/-1.6 mm、背腹腹 (DV): -2.1 mm。カニューレを挿入するには、使用するカニューレのサイズに応じた穴の直径で、目的の座標で頭蓋骨に穴を開けます。
   注: ここでは、PFC は、痛みの処理における重要な役割のため、頭蓋内インプラントの潜在的な標的として研究されており、これは以前の多くの研究で実証されています。他の特定の脳領域の機能を研究するために、研究者は脳アトラスに従ってさまざまな座標を使用できます。
4. ラットが少なくとも1週間手術から回復するのを待ちます。手術後は、代謝要件をサポートするために回復前に皮下輸液を注射し、閉じたばかりの切開部に局所ブピバカインを塗布します。目が覚めるまで動物を暖かいパッドの上に置き、手術後に3日間動物を監視して、健康と適切な回復を確保します。
5. 動物が手術から完全に回復したら、注射を開始します(次のステップ)。

2. 頭蓋内および腹腔内注射頭

1. 蓋内注射の場合は、10 μL ハミルトン シリンジの一端に取り付けられた PE-50 チューブと、移植されたガイドを超えて 1.0 mm 伸びる 33 ゲージのインジェクター カニューレを使用します。
2. これらのラットのPFCに治験薬または生理食塩水のいずれかを0.5 μL(または必要に応じてそれ以下)注射します。ラットではPFCが広い領域であるため、この量が他の領域に広がることはありません。ただし、より小さな脳領域またはマウスの場合は、より小さな容量を使用してください。注射量は、脳の領域と動物の種類によって異なります。
   注:DMSOは神経毒性があるため、ジメチルスルホキシド(DMSO)の代わりに生理食塩水をコントロールとして使用する必要があることに注意してください。ただし、DMSOが50%未満(つまり、この場合のように総体積が0.3μL未満)が挙動研究を妨げない可能性があることが研究で示されているため、非常に少量のDMSOは注入に安全である可能性があります。
3. 100秒にわたって両側にボリュームを注入し、この溶液のゆっくりとした拡散を可能にするために、取り外す前にインジェクターカニューレをさらに60秒間所定の位置に保持します。
4. 相乗的な薬理効果の研究のために、全身法で別の薬剤を同時投与する。この場合、所望の薬剤を注射するか、頭蓋内をコントロールし、その後すぐに腹腔内に追加の薬剤を投与する。一例として、本研究では、モルヒネとアンパキンの相乗的な鎮痛効果を研究し、相加効果をテストしました。AMPAkineを頭蓋内注入し、1 mg/kgモルヒネ(安全な全身用量)の腹腔内送達と組み合わせて注入しました。
   注:腹腔内注射よりも実行が難しいため、頭蓋内注射を最初に行うことをお勧めします。

3. 鎮痛アッセイと評価

1. ラットの急性疼痛行動に対する頭蓋内注射の効果を研究するには、足底検査 (ハーグリーブス検定) を使用して、熱刺激に反応した離脱潜時を計算します。ハーグリーブスの装置は、ガラス面を通して赤外線ビームをネズミの足に焦点を合わせます。ネズミはガラス面の上を立って自由に動き回っています。ハーグリーブステストを実行するときは、ラットの足の足底領域の下に赤外線ビームを集中させます。まず
   1. 、注射前にベースラインハーグリーブステストを実行して、比較用のベースライン値を確立します。
2. ベースライン値を確立する前に、いかなる種類の薬物も注射しないでください。5分間隔で5回の適切な試験を実施します。良い試験は、明確な離脱、つまりラットが膝を曲げて足を上に持ち上げて体内に持ち上げたときによって示されます。
   注:ラットの感作を防ぐために、試験が5分間隔にあることを確認してください。ハーグリーブスの装置は、赤外線ビームが破壊されると、撤退時間を自動的に記録します。その結果、移動や体重移動などによる試行は必ず割り引いてください。割引トライアルが発生した場合は、5 分間待ってからトライアルを繰り返します。
5回の
3. 試行の平均を取って、離脱しきい値を計算します。
4. ベースライン平均を取得した後、実験を開始して、薬物注入後の離脱時間を取得します。ハーグリーブス検査は頭蓋内注射の20〜30分後に実施できますが、正確なタイミングは特定の薬剤の薬物動態に依存する可能性があります。これは、ラットが薬を吸収し、その効果を経験していることを確認するためです。この実験は、手順3.1と同じ方法で行います。
5. 手順 3.2 で説明したように、出金しきい値を計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステロタキックカニューレ	プラスチックOne	8I26GA8MMKIT
デジタルシリンジハ	ミルトン	8440AMPAkine
	Sigma Aldrich	C-271
メチルスルホキシド	シグマ アルドリッチ	D4540
ハーグリーブス	ウーゴ バジール	37370
オス スプレイグ ドーリー ラット	タコニック ファームズ	NTac:SD
滅菌手術用手袋	ダイナレックス	6535

ジ装置