マウスモデルにおける聴覚回復のためのウイルスベクターベースの遺伝子治療

要約

出典: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane.J. Vis. 経験。 (2015年)

このビデオは、遺伝性難聴のマウスの子犬の内耳に治療遺伝子を送達する手順を示しています。アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターを使用して、遺伝子を丸い窓膜から注入し、ウイルス粒子が有毛細胞に侵入し、グルタミン酸トランスポーター産生を回復し、脳への音声シグナル伝達を再確立します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の手術準備:

1. 清潔な専用スペースで外科手術を行います。すべての手術器具をオートクレーブし、手術前にガラスビーズ滅菌器で滅菌します。
   注:このプロトコルでは、生後10〜12日目(P10〜12)FVBマウスを使用します。特定のプロジェクトのニーズを満たすために、さまざまな年齢と系統のマウスを使用できます。P40 より古いマウスは、水疱の骨が硬くなるため、困難な場合があります。
2. 塩酸ケタミン(100 mg / kg)、塩酸キシラジン(10 mg / kg)、およびアセプロマジン(2 mg / kg)の混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔します。動物がつま先をつまむなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなった後にのみ、外科的準備を開始してください。必要に応じて、麻酔カクテルの追加用量(元の用量の5分の1)を投与して、元の麻酔面を回復します。
   注:この年齢で観察される死亡率のほとんどは麻酔薬の過剰摂取によって引き起こされるため、このステップでは注意してください。
動物
3. の目を保護眼科軟膏で覆い、麻酔中に目を湿らせ、動物のまばたき反射を抑制します。
4. 麻酔後の低体温症を防ぐために、マウスが完全に目覚めるまで、手順全体を通して首を温熱パッドの上に伸ばしてマウスを配置します。
5. 外科的操作の前に、バリカンで左耳介後領域を剃り、70% エタノールとポビドンヨードで消毒します。

2. 外科的処置とベクター注射

1. 耳介後アプローチを使用して鼓膜水疱を露出させます。小さなはさみで皮下組織を切開し、耳介後の筋肉を露出させます。脂肪組織を切開部の後側に引っ込めた後、切開部に垂直な左右の筋肉を分離して側頭骨を露出させます。この切開が十分な長さで、適切な視覚化で快適に作業できることを確認してください。
2. 鼓膜水疱に25 Gの針を穿孔し、必要に応じて鉗子で穴を広げて骨を剥がして蝸牛の基底回転にアクセスできるようにし、骨筋動脈と丸窓膜(RWM)を視覚化するために十分に広げます。
ホ
3. ウケイ酸キャピラリーピペットでRWMの中央にそっと穴を開けます。この時点で、RWMを通る流体の流出を観察します。これは正常です。流出液が安定するまで待ちます(蝸牛から流出した液体は滅菌濾紙で乾燥します)。
   注:RWMミシン目ができるだけ小さくなるように、ガラス針を持って前進させるときは注意してください。使用する顕微鏡に応じて、マイクロマニピュレーターを使用するか、ピペットホルダーを使用して手でピペットを持ちます。
4. パッチクランプピペットを準備するのと同じ方法で、ピペットプーラーを使用して注射用のピペットを準備します。チップの直径が大きい(直径約15μm)ことを確認し、ウイルスのピペッティングとピペッティングが容易に行われるようにします。
5. 1〜2 μlのアデノ随伴ウイルス(AAV1-VGLUT3、AAV1-GFP、またはAAV2-GFP)を注射ピペットに引き上げます。流出液が安定した後(5〜10分)、この固定量をRWMで以前に開いたのと同じ穴から鼓室鱗にマイクロインジェクションします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン	バトラー シャイン
キシラジン	アセプロ
マジン	UCSF LARC
タジン ベタ	ジンPuredue Pharma
デキサメタゾン点眼軟膏 (TobraDex)	Alcon
加熱パッド	Braintree scientific, inc.
25Gニードル		305127
ホウケイ酸キャピラリーピペット	precision instruments、inc.	1B100F-4
顕微鏡	カ		MZ95
ーミング/ブラウンマイクロピペット	サッター機器Co
プーラーモデルP-97
TDT BioSig IIIシステム	ッカーデイビステクノロジーズ

提供 ベBD World 解剖ライフレタ