マウス脳におけるヒト神経前駆細胞のin vivo生物発光イメージング

要約

出典: Weber, R. Z., et al., Inbrainrebral Transplantation and in vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain.J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、マウスの脳に注入された遺伝子組み換えヒト神経前駆細胞のin vivo生物発光イメージングの方法を示します。このプロセスには、ルシフェリン注射、画像処理、および注射部位での移植細胞からの生物発光シグナルの検出が含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

イン

ビボイメージング

1. ルシフェリンの調製
   室
   1. 温(RT)でD-ルシフェリンカリウム塩を解凍し、PBS中で30 mg / mLのD-ルシフェリンの新鮮なストック溶液を調製します。
   2. 0.22 μmシリンジフィルターを介してストック溶液を滅菌します。
      注:作業溶液を直ちに使用することをお勧めします。必要に応じて、溶解したルシフェリンを-20°Cで保存できます。ただし、長期間保管すると信号が劣化する可能性があります。ルシフェリンは感光性試薬です。可能な限り直射日光を避けてください。分離能限界を改善するために、代替基質、例えばcyclucも検討されるかもしれない。
2. Imaging
   1. 初期セットアップ
      注:生物発光イメージングは、暗いチャンバーと冷却電荷結合素子(CCD)カメラで構成されるin vivoイメージングシステム( 材料表を参照)を使用して実行されました.
      1. Living Image ソフトウェア アイコンをダブルクリックし、ドロップダウン リストからユーザー ID を選択します。
      2. 表示されるコントロールパネルで[初期化]をクリックします。初期化プロセスが完了すると、コントロール パネルの温度ボックスが緑色に変わります。
      3. コントロールパネルで、発光ボックスと写真ボックスをオンにし、自動露出(~60秒)を選択します。視野を選択します(このプロトコルではD/12.5cmが選択されました)。被写体の高さ(1.5 cm)を入力し、被写体の高さのフォーカスを使用するオプションを選択します。次のパラメータを手動で設定します:ラージビニング、f / 2、ブロック励起フィルター、およびオープンエミッションフィルター。
   2. 300 mg / kg体重でのD-ルシフェリンの注射量を決定します。
      注:標準推奨用量は150 mg / kgのD-ルシフェリンです。この手順は、300 mg/kg を使用してより高い感度を報告するプロトコルに従って調整されました。
   3. ルシフェリンを腹腔内(i.p.)注射します。
      注:注射前に動物を鎮静する必要がある場合は、ピークルシフェラーゼ発現時間が延長される可能性があることに注意してください。
   4. 5分間待ってから、イソフルランの連続供給で動物を麻酔します(イメージング手順中の導入期で4.5%、維持期で1.5〜2%)。
   眼科
   5. 用潤滑剤を目に塗布し、従来のヘアシェーバーを使用して鎮静した動物の頭の部分を剃ります。動物をイメージングチャンバーに入れ、ルシフェリン注射の15分後にコントロールパネルの[取得]をクリックしてイメージングを開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
消耗品シ
リンジフィルター; 0.22 μm	TPP	99722
機器
加熱パッド			最適な製品
生体内イメージングシステム(IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2ソフトウェアパッケージ)	Perkin Elmer	CLS136334
イソフルラン気化器	Provet AG	330724
および試薬
D-ルシフェリンカリウム塩	Perkin Elmer	122799
エタノール、70%			選択製品
イソフルラン (イソフルラン (1-クロル-2,2,2-トリフルオロエチル-ジフルオロメチルエーテル) 99.9%)	Provet AG	医薬品は、スイス、チューリッヒの州薬局から提供されました
		すべての医薬品は、スイスのチューリッヒにある州の薬局によって提供されました

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