マウスの子犬海馬へのヒト由来介在ニューロン前駆細胞の移植

要約

出典: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 神経発達障害を軽減するための出生後早期マウス海馬へのヒト幹細胞由来 GABA 作動性ニューロンの移植。J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオでは、興奮性抑制性バランスの回復を目的として、抑制性介在ニューロンを減少させた遺伝子組み換えマウスの子犬の海馬にヒト由来介在ニューロン前駆細胞を定位固定注射

する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.海馬内細胞移植

注:このセクションのすべてのステップは、動物施設の細胞培養フードの外で実行されます。出生後早期の脳への細胞移植は、出生日のP0を考慮して、P2で行われました。

以下の

1. 手順で移植実験の準備をします。
   1. すべての手術材料をオートクレーブするか、不可能な場合は別の承認された方法で滅菌します。
   2. ガラスキャピラリーなしで、注射シリンジをホルダーに取り付けます。針を水ですすいでください。
      注:針は33Gでなければなりません。
   3. 30 Gのインスリン針の先端を90°カーブさせます。
   4. 子犬を頭を平らにして配置するための自家製のプレイドーのようなステージを作成します(図1A)。
   新しい環境に慣れる
   5. ために、手術のために何かを準備する前に、母親と子犬と一緒にマウスケージを持ってきてください。
   6. 湿った氷の入ったトレイと、イソフルラン用の紙を入れた空のケージを準備します。
2. マウスの子犬を麻酔します。
   1. 紙をイソフルランに浸し( 材料表を参照)、空のケージの中に入れます。1匹の子犬を慎重に取り、イソフルランに浸した紙でケージに入れます。
      注:3匹未満の子犬を母親と一緒に残さないでください。イソフルラン麻酔の20〜30秒を超えないように、子犬が死ぬ可能性があります。
   2. 運動停止による麻酔効果の検証。
   3. 麻酔直後に、子犬を濡れた氷の表面のウェットティッシュの上に置きます。上肢が白くなってしまうまで、動物を氷の上に3分間置きます(図1B、青い矢印)。通常、これには2〜3分かかります。
   4. この時間を使用して、シリンジに細胞懸濁液をロードします。前にピペットで細胞を慎重に再懸濁します。
   5. 子犬を定位固定フレームに置きます。イヤーバーを反対方向に使用します(図1A、マゼンタの矢印)。
      注:イヤーバーの裏側は尖っておらず、P2の子犬には耳がないため、動物を傷つけないように平らな側を使用してください。
   6. 横から、頭がまっすぐかどうかを確認します。頭は平らでなければなりません。プレイドーのようなステージを使用して調整してください。
      注:この年齢の子犬はまだ目を開けていないため、この点に関して追加の手順を実行する必要はありません。この年齢の子犬には毛皮がないので、その部分を剃る必要はありません。皮膚への開いた切開ではなく、縫合も伴わないため、特別な痛みの治療は行われません。
   7. 手術中ずっと、子犬を氷(ティッシュペーパーの上)で覆い続けてください。
      注:氷を子犬の皮膚に直接触れさせないでください。
3. 注入を行います。
   1. エタノールに浸した軟部組織を使用して皮膚の表面をきれいにします。
   2. ラムダを識別し、定位固定装置のデジタルディスプレイコンソールで座標をゼロに設定します(図1C、黄色の破線)。矢状縫合糸とラムドイド縫合糸は、赤い線として血管新生されているため、目に簡単に見えます。
      注:ラムダを視覚化するのが難しい場合は、皮膚に小さな氷片を置き、冷めるまで数分待ちます。そして、氷片を取り除くと、肌の微妙な白化が視覚化できるようになります。
   3. 注入針を目的の座標に再配置します。記載されたプロトコルでは、標的領域は海馬であり、座標は次のとおりであった:前後(AP)+0.85および中外側(ML)+1.35。
   4. 90°曲げたインスリン針を使用して頭蓋骨を貫通し、小さな穴を作ります。
   5. 頭蓋骨を横切るまで注射針を下ろし、背腹(DV)座標をゼロにします。目的のDV座標まで針を下げます。記載されたプロトコルでは、座標はDV-1.1でした。
   所
   6. 定の時間間隔に従って注入します。
      注:記載されているプロトコルでは、正確なタイミングは次のとおりです:(i)DV座標まで下がった後、3分間待つ、(ii)1 μLの容量を5分間注入し、(iii)すべての容量が注入された後、3分間待ちます。
   7. 針をゆっくりと引っ込めます。
4. 手順を終了します。
   注:子犬の生存を確保し、低体温症による麻酔に由来する損傷を避けるために、手術は15分以上続くことはできません。
   子
   1. 犬が動き始めるまで手でウォームアップしてから、母親に返します。
   2. 0.5%スクロース溶液に1mg / mLの濃度でDOXを飲料水として少なくとも2日間、移植(PT)の少なくとも2日前と3週間後投与して、in vivoで細胞分化を継続します。

結果

図1:P2の新生マウス子犬におけるSテレオダキック移植。)プレイドーのようなステージを使用して、子犬の体を所定の位置に保持し、イヤーバーを逆さまにします(マゼンタの矢印)。(B)白い前足(青い矢印)は、その領域の血流の減少を示しているため、子犬は低体温症による麻酔を経験しています。(C)子犬がソフトティッシュペーパーの上ですでに氷で覆われているセッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30 G 針	B Braun	4656300
33 G 針 ハミルトン注射器用	Hamilton	7762-06
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J	Jackson Laboratory	17482	動物模型
C57BL/6J	Janvier Labs		動物モデル
デジタルステレオタックス	KOPF	モデル 940
ドキシサイクリン	シグマ・アルドリッチ	D9891	2 μg/mL
エタノール	ソルベコ		70%、95%、99.8%
H1 (WA01) ESC	WiCell	WA01	MTA 契約に基づくヒト胚性幹細胞株
ハミルトンシリンジ	Hamilton	7634-01	5 μL
イソフルラン バクスター	Apoteket AB
ステレオタックス	RWD	68030
プロマイシン (二塩酸塩)	Gibco	A1113803
ピンセット	VWR

へのマウスアダプター