マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

1. 焦点DNA注入<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. 発現ベクターのデオキシリボ核酸(DNA)混合物を、各ベクターの濃度でpCAGGs-IRES-GFP(コントロールベクター)+ pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFPで調製します。高速グリーン溶液(ストック25 mg / mL)を1/10希釈で加えます。
3. プルドガラスマイクロピペット(内径0.5 mm、外径1 mm)に10 μLのDNA混合物を充填し、スライスの選択された領域(内側神経節隆起またはMGE/尾側神経節またはCGE)に少量(25〜50 nLの範囲)を注入します(図1および図2)。

図1:急性エレクトロポレーション実験に使用される代表的な終脳スライス。(A-C)Telencephalic スライスは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色された 3 つの異なる連続した吻尾レベルで得られました。LGE:外側神経節隆起;MGE:内側神経節隆起;CGE:尾側神経節隆起。スケールバー = 200 μm。黄色のアスタリスクは、各スライスのエレクトロポレーション部位を示します。白い線は神経節隆起の端を示しています。

図2:実験ワークフローの概略図。(A)マウスの脳スライスを適切なコンストラクトでエレクトロポレーションし、(B)12時間後、修飾された皮質介在ニューロン(CI)前駆体を単離し、(C)新生マウスの子犬のパリウムに移植します(P0-P2)。未熟なCIの活性を修飾するために、細胞移植を受けたP14の子犬に、提示されたプロトコルに従って、CNOまたはビヒクルを4日間注射しました。(A')急性マウス脳スライスエレクトロポレーションセットアップの写真。

図3:代表的な急性スライスエレクトロポレーション実験の成功例。(A)pCAGGs-IRES-GFP(緑色蛍光タンパク質)とpCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP(赤色蛍光タンパク質)プラスミドの両方をCGEにトランスフェクトし、12時間培養したE14.5胚脳からの代表的な冠状切片。この切片は、GFP (A、B、C) および RFP (A、B、D) について免疫染色されています。パネルAのボックス領域を拡大して、蛍光レポーター(B)、GFP(C)、およびRFPのみ(D)の両方の発現を示します。白い線は神経節隆起の端を示しています。B-D:同じ写真、異なるチャンネル、または2つの異なるチャンネルの組み合わせ。スケールバー = 200 μm (A)、100 μm (B-D)。