マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

要約

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、目的の遺伝子を運ぶプラスミドベクターを胚性脳スライスの介在ニューロン前駆細胞に注入し、その後プラスミドの侵入と遺伝子発現のためのエレクトロポレーションを行う手順を示します。これらの修飾された前駆細胞は、後で脳障害の治療に使用できます。

プロトコル

1. 焦点DNA注入<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. 発現ベクターのデオキシリボ核酸(DNA)混合物を、各ベクターの濃度でpCAGGs-IRES-GFP(コントロールベクター)+ pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFPで調製します。高速グリーン溶液(ストック25 mg / mL)を1/10希釈で加えます。
3. プルドガラスマイクロピペット(内径0.5 mm、外径1 mm)に10 μLのDNA混合物を充填し、スライスの選択された領域(内側神経節隆起またはMGE/尾側神経節またはCGE)に少量(25〜50 nLの範囲)を注入します(図1および図2)。

急性エレクトロポレーション
注:エレクトロポレーションは、焦点DNA注射の直後に実行する必要があります。

1. 小さなアガロースブロックをペトリ皿電極に置き、平らな端のマイクロスパチュラを使用してアガロースカラムをモバイルカバー電極に取り付けます。
支持
2. 膜を備えたスライスをアガロースブロックに移し、アガロースカラムを備えた上部電極をスライスの選択領域(MGE / CGE)の上に置きます。
   注:125Vの充電電圧(それぞれ5ミリ秒の2つのパルス、間隔500ミリ秒)は、エレクトロポレーションに成功します(図3)。

エレクトロポレーション後、スライスを支持膜とともに皿に入れ、37°Cの_CO2組織培養インキュベーターに移します。

結果

図1:急性エレクトロポレーション実験に使用される代表的な終脳スライス。(A-C)Telencephalic スライスは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色された 3 つの異なる連続した吻尾レベルで得られました。LGE:外側神経節隆起;MGE:内側神経節隆起;CGE:尾側神経節隆起。スケールバー = 200 μm。黄色のアスタリスクは、各スライスのエレクトロポレーション部位を示します。白い線は神経節隆起の端を示しています。

材料