脊髄および眼球筋萎縮症マウスモデルにおける組換えアデノ随伴ベクターの注入

要約

出典:
Pourshafie, N., et al.げっ歯類の神経筋疾患を治療するための組換えアデノ随伴ウイルス血清型9を用いたマイクロRNAの全身送達J. Vis. Exp. (2018)。

このビデオでは、脊髄および眼球性筋萎縮症またはSBMAに罹患したマウスに、治療用マイクロRNAをコードするプラスミドを運ぶ組換えAAV(アデノ随伴ベクター)ベクターの尾静脈注射を受けます。このベクターは、変異型AR(アンドロゲン受容体)-mRNA(メッセンジャーリボ核酸)に結合するマイクロRNAを産生し、その分解を引き起こします。これにより、有毒なタンパク質の蓄積が減少し、神経筋機能の改善に役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. AAV-miRNAプラスミドの尾静脈注射

注

:このステップは、標的遺伝子とマウスの年齢と体重に応じて調整する必要があります。施設および動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のガイドラインを使用して、マウスの年齢と体重に基づいて用量範囲、量、および最適な投与経路を決定します。標的組織におけるGFP(緑色蛍光タンパク質)蛍光シグナルおよびmiRNA発現レベルは、注射後2週間からピークに達すると予想されます。以下のプロトコルは、成人期初期の雄マウスに言及しています。AAV は、バイオセーフティ レベル 1 ガイドラインに基づいてバイオハザードとして取り扱う必要があります。

1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して、10^{10-10 11} ウイルスゲノム/mL(vg/mL)のウイルス量を含む100-200 μLアリコートにAAV-miRNAプラスミドストックを分割します。AAV溶液を取り扱うには、実験室のバイオハザード個人用保護具を使用する必要があります。
   注:アリコートが解凍されると、4°Cで最大2週間保存できます。ウイルスストックは-80°Cの冷凍庫で保存できます。
2. 適切なサイズのプラスチックまたはテーパープラスチックフィルムチューブなどの市販の拘束装置でマウスを拘束します。
3. テールの表面はアルコール70%のワイプできれいにします。
4. 血管拡張を促進するために、尾の下に温かいパッド(28〜30°C)を30秒間保持します。あるいは、赤いヒートランプ(2〜3フィートの距離)を使用するか、尾を温水に浸して動物を温めます。
5. 尾の遠位部分から始めて、ウイルスアリコートを充填した針(27〜30 G)を尾から15°面取りして静脈に挿入します。注射する前に、針が正しく挿入されていることを確認してください。
   1. 注射中に抵抗を感じたり、皮膚の下に腫れが現れたりした場合は、施術を中止してください。針を取り外し、前の注射部位の上に再度挿入します。
      注:または、針を穏やかに吸引して血液を観察することによって、これは達成できます。強い吸引は尾静脈を崩壊させる可能性があります。注射中に静脈が白くなる場合は、針が正しく挿入されています。
6. 注射が完了したら、数秒待ってから針を上げます。
7. 注射部位の出血を観察します。出血が止まるまで、2本の指を使って部位に適度な圧力をかけます。
8. 動物をケージに戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
スケール	Pelouze	SP5
Nalgene バケット	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
マイクロ遠心チューブ	USA Scientific	1615-5500
乳酸リンゲル病ソリューション	バクスターヘルスケア	0338-0114-04
ミニボルテキサー	フィッシャーサイエンティフィック	128101
遠心分離機	エッペンドルフ	22624415
実験用フィルム	Bemis	PM996
1 mL シリンジ	BD	309626	25g の針が付属しています。注射用針 27-30g と交換してください
BD 30g 針	305106
イソフルラン	ピラマル ヘルスケア	66794-013-25	イソフルラン USP 250 mL
麻酔マスク	Kopf Instruments	906
ガーゼ	ヘンリー シャイン	100-2524	2 インチ x 2 インチ (5cm x 5cm)
ピペットチップ	USA Scientific	1111-0816
マイクロピペット	ギルソン	4642080
ガス麻酔気化器	SurgiVet	4214322	Classic T3
ガス麻酔スカベンジャー	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
加熱パッド	Sears	17280
ベンチパッド	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	ラット4匹/マウス4
70%エタノール	Decon Laboratories, Inc.	2401	140プルーフ
70%イソプロパノール	VWR	89108-160

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